이 프로토콜은 다른 Vigilin 상태 도중 전기 검사 활동의 규칙에 있는 특정 개별 분자 표적의 역할을 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다. 아데노 관련 바이러스를 사용 하 여의 혜택 중 정확 하 게 주어진된 뇌 영역 및 특정 세포 유형을 대상으로 하는 기능. 프로토콜을 시연하는 것은 줄리안 듀포르-게르바이스(Julien Dufort-Gervais)가 될 것이며, 우리 팀의 연구 동료입니다.
마취 된 12 주 된 마우스에서 발가락 핀치 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 머리 트리머를 사용하여 눈 사이의 머리 의 전면에 귀의 뒷면에서 머리를 면도. 각 눈에 안과 연고의 넉넉한 방울을 추가하여 탈수를 방지하고 이어 바를 사용하여 마우스의 머리를 스테레오탁스 장치에 조심스럽게 고정시하십시오. 질식을 피하기 위해 입에서 혀를 부드럽게 당깁니다.
마우스의 코를 장치에 고정하고 머리에 노출된 피부를 살균하기 위해 70%에탄올을 사용합니다. 여분의 미세 Graefe 집게와 피부를 잡고, 눈의 수준에 귀의 기지에서 피부를 잘라 하 고 피부를 스트레칭 하 고 두개골을 노출 하는 절개의 각 측면에 두 개의 수술 클램프를 배치 하는 조직 가위를 사용 하 여. 뇌 봉합사를 피하고, 가위 팁을 사용하여 두개골 표면을 긁어 폐막을 제거하고 두 개 이상의 방향으로 겹치는 줄무늬를 만듭니다.
70%에탄올을 사용하여 뼈 조각을 제거하고 두개골을 소독하십시오. 이전에 준비된 캐뉼라가 스테레오탁스 암에 고정되어 있는 가운데, 브레그마와 람다의 위치를 파악하고 각 의 스테레오탁스 좌표를 기록합니다. 스테레오탁스 팔과 펜을 사용하여 두개골의 캐뉼라의 위치를 표시하여 중간선에 1.5밀리미터 측면 오른쪽, 브레그마에 1.5밀리미터 전방을 표시합니다.
0.7 밀리미터 드릴 비트를 사용하여 두개골 표면에 수직으로 표시된 위치에서 두개골을 조심스럽게 관통하고 수직 축과 정렬하여 10 % 베타딘 포비도네 요오드 용액에 담근 멸균 면 끝으로 두개골을 씻은 다음 10 마이크로 리터 주사기의 플런저를 한 마이크로 리터로 하중시켜 미세 조명을 사용하여 캐뉼러를 적재합니다. 다음으로, 관심있는 AAV 혼합물을 느린 파이펫팅과 혼합하고 멸균 페트리 접시에 혼합물의 1.7 마이크로 리터를 추가하십시오. 이 주사기를 사용하여 용액의 1.5 마이크로리터를 캐뉼라에 적재하고 연결된 PE50 튜브의 기포 위치를 표시하십시오.
캐뉼라가 뼈의 위쪽 가장자리에 도달하고 두개골 표면의 Z 좌표를 표시할 수 있도록 캐뉼라를 두개골의 구멍과 수직으로 정렬합니다. 팁이 두개골 표면 아래 1.5 밀리미터에 도달하고 모터 피질의 5 층에 도달할 때까지 캐뉼라를 천천히 낮추고 분당 0.025 마이크로리터로 주사기 펌프를 시작하여 40분 이상 AAV 1마이크로리터를 제공합니다. 튜브의 기포를 사용하여 주입을 추적하여 필요에 따라 조정하십시오.
바이러스의 전체 부피가 전달되면, 충분한 확산을 보장하고 천천히 조심스럽게 피질에서 캐뉼라를 제거하기 위해 스테레오 탁스 팔을 들어 올리기 전에 역류를 피하기 위해 5 분 동안 장소에 캐뉼라를 둡니다. 전극 이식의 경우, 직선 켈리 집게를 사용하여 AAV가 주입된 구멍의 수직 축으로 직선 금 와이어로 한 전극을 천천히 나사로 연결하여 두개골 바깥쪽에 2.5밀리미터 의 나사를 남기고 두라와 대뇌 피질의 손상을 최소화하십시오. 펜을 사용하여 미드라인에 대한 2.6밀리미터 측면 오른쪽 및 0.7밀리미터 후방의 브레그마및 후방 심전도 전극의 위치가 중간선까지 1.5밀리미터, 람다에 1.5밀리미터 전방, 좌반구의 3개의 유지보수 나사의 위치를 표시합니다. 그러나 서로 와 전극에서 가능한 한 멀리 떨어져 있습니다.
드릴을 사용하여 다른 전극과 나사의 표시된 위치에서 두개골 표면에 수직으로 두개골을 조심스럽게 관통하고 10 % povidone 요오드 용액으로 관통 된 두개골을 씻으려면 드릴을 사용합니다. 출혈과 오염을 방지하기 위해 나사를 설치하기 전에 섬세한 작업 닦기의 작은 압연 조각으로 구멍을 차단하고 구멍이 관통 된 것과 같은 각도로 드릴 구멍에 나사를 삽입 직선 켈리 집게를 사용합니다. 몇 방울의 치과 시멘트를 나사 내부의 링 과 같은 공간의 중앙에 넣고 엑스트라 미세 Graefe 집게를 사용하여 목 근육 위의 피부를 들어 올립니다.
Dumont 넘버 5 포셉을 사용하여 한 전극의 곡선 단전도를 잡고 근육에 약 1~2밀리미터를 삽입합니다. 전극의 곡면과 접이식 점을 치과 시멘트에 넣고 두 번째 전극전극을 동일한 방식으로 삽입합니다. 동물의 눈을 가린 후, 시멘트를 고화시키기 위해 3~5분 동안 빛을 바르고, 추가 치과 시멘트를 사용하여 전극 전극과 앵커 나사의 베이스를 덮어 크라운 모양의 윤곽을 형성한다.
3~5분 더 가벼운 빛을 바른 후 몽타주 중심을 아크릴 시멘트로 채우고 수술 용 클램프를 제거합니다. 합성 흡수성 monofilament 봉합사를 사용하여 몽타주 앞면과 뒤쪽의 피부를 닫고 곡선 집게를 사용하여 전극의 금 전선을 커넥터 핀과 조심스럽게 정렬한 다음 각 전극 의 말단을 단일 커넥터 핀으로 신속하게 솔더링합니다. 프레임에서 마우스를 제거한 후 아크릴 시멘트로 커넥터와 헤드 사이의 빈 공간을 덮습니다.
계량 한 후, 열 패드에 비 메쉬 뚜껑이있는 깨끗한 케이지에 마우스를 놓습니다. 수술 후 2 주, 기록 케이블에 마우스를 연결하고 적어도 1 주일 후, 24 시간 이상 전극 및 전동 신호를 기록합니다. 성공적인 감염은 주입 부위를 둘러싼 운동 피질 내의 신경세포를 HA 염색하여 확인되며, 이는 코필린 S3D HA의 존재를 나타낸다. 흥분성 뉴런 마커 CaMKII 알파와 공동 염색은 높은 배율 하에서 명확한 코필린 S3D HA 및 CaMKII 알파 공동 발현을 나타낸다.
로그는 깨어, 느린 파도 수면 및 역설적인 수면에 대한 상대적 전력 스펙트럼을 변형시켰으며, 코필린 불활성화 하에서 스펙트럼 활동의 상태별 차이를 보여줍니다. 정밀 분자 표적의 전극 기록 및 AAV 매개 조작의 조합은 또한 다중 두뇌 지구 및 수면 이외에 간질 또는 기억에 대한 연구와 같은 그밖 신경 과학 하위 필드에 적용됩니다.
