이 프로토콜은 항체를 가진 다중 PTM의 동시 농축을 위한 새로운 기술을 설명하고 사이트 현지화 및 교차 토크에 대한 생물학적 통찰력을 얻기 위하여 데이터 독립적인 취득 질량 분광분석 분석뒤에 선행됩니다. 이는 소량의 시료 입력만으로 아세틸화 및 간결 PTM을 포함하는 슬라이스로 펩타이드를 동시 식별 및 정량화할 수 있는 시간 및 비용 효율적인 기술입니다. 번역 후 수정을 추적하는 것은 다른 질병 상태를 특성화하고 퇴치하는 중요한 단계입니다.
우리는 이미 특정 암과 당뇨병이 단백질 수정을 통해 높게 통제된다는 것을 알고 있습니다. 이 방법은 이론적으로 유비퀴티닝, 인산화 및 기타와 같은 농축을 위해 항체를 가진 모든 PTM에 적용될 수 있습니다. 그것은 또한 다른 조직 유형 또는 세포 배양 모델에 적용 할 수 있습니다.
이 기술을 사용하여 귀중한 데이터를 얻는 열쇠는 재현성입니다. 이것은 모든 단계가 항체 구슬을 관련시키는 단계 특히 아주 신중하게 수행되도록 함으로써 달성될 수 있다. 시작하려면 최대 10밀리그램의 단백질을 결합한 C18 수지가 함유된 카트리지를 얻습니다.
이 카트리지를 진공 장치에 맞춥니다. 80%의 아세토나이트와 0.2%의 마이크로리터를 카트리지에 19.8%의 물로 추가하고 진공 흡입을 시작하여 액체를 통과합니다. 이 단계를 한 번 반복하여 카트리지의 건조를 완전히 피하십시오.
진공 흡입이 있는 물에 0.2%의 마이크로리터 800마이크로리터를 추가하여 카트리지를 평형화합니다. 이 것을 두 번 반복합니다. 진공 흡입을 통해 카트리지에 약 1, 000 마이크로리터 용액에 1밀리그램 펩티드를 적재합니다.
진공 흡입 하에서 물에 0.2 %의 마이크로 리터 800 마이크로 리터로 펩티드를 두 번 세척하십시오. 그런 다음 각 카트리지 아래에 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기를 배치하여 펩티드를 수집합니다. 진공 흡입 하에 카트리지의 엘루트 펩타이드는 800 마이크로리터800 마이크로리터와 19.8%의 물에서 0.2%의 포믹산을, 400마이크로리터가 동일한 용액의 마이크로리터로 먼저 배출된다.
무염 펩티드 샘플을 진공 농축기에서 2~3시간 동안 완전히 건조시다. 지금, 감기 1X 면역화 정제 완충제의 1.4 밀리리터에서 말린 펩티드를 재중단한다. 소용돌이는 약 7의 pH를 혼합하고 보장합니다.
샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 10, 000배 g로 원심분리합니다. 작은 펠릿이 나타납니다. 항체 구슬을 준비하는 동안 펩티드를 얼음 위에 따로 놓습니다.
K-아세틸 항체 비드 슬러리 100 마이크로리터를 함유한 튜브에 차가운 1X PBS 1밀리리터를 추가하고, K-succinyl 항체 비드 슬러리 100마이크로리터를 함유한 튜브를 배관하여 혼합합니다. 전체 솔루션을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 실온에서 30초 동안 소형 원심분리기에서 회전합니다. 구슬을 떼어내지 않도록 주의를 기울이는 PBS를 흡인하십시오.
세 번 더 씻는 것을 반복하십시오. 다음으로 PBS의 약 440 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단하십시오. 구슬을 여러 번 파이펫으로 잘 섞어 주시습니다.
200 마이크로리터 프리컷 팁으로 각 아세틸리신 항체 비드와 간결한 항체 구슬 100개를 새로운 튜브로 옮길 수 있습니다. 미니어처 원심분리기에서 30초 동안 회전하고 젤 로더 팁으로 미디어를 흡입합니다. 구슬은 이제 흰색으로 바뀝니다.
파이펫은 세척된 구슬에 직접 다시 매달린 펩티드를 배양하고 밤새 섭씨 4도에서 구슬로 펩티드를 교반하여 배양합니다. 아침에는 펩티드 샘플을 섭씨 4도에서 30초 동안 2, 000배 g에서 회전합니다. 바운드되지 않은 펩티드를 함유한 상체를 제거하고 원하는 경우 향후 실험을 위해 저장하십시오.
차가운 1X 면역affinity 정제 버퍼 1 밀리리터를 구슬에 추가하여 5번 반전하여 세척하고 섞습니다. 섭씨 4도에서 30초 동안 2, 000배 g에서 회전합니다. 면역affinity 정제 용액을 흡습하고 면역 affinity 정제 세척 단계를 한 번 더 반복합니다.
그런 다음 차가운 HPLC 물 1 밀리리터를 구슬에 넣고 5번 반전하여 섞습니다. 섭씨 4도에서 30초 동안 2, 000배 g에서 회전합니다. 물을 흡입하고 물 세척 단계를 2 번 더 반복합니다.
2, 000g에서 섭씨 4도에서 30초 동안 추가 시간을 회전하여 튜브 바닥에 남은 물을 채집합니다. 평평한 팁 젤 로딩 팁으로 수집 한 여분의 물을 흡입하십시오. 구슬을 흡입하지 않도록주의하십시오.
물에 0.15%의 트리플루오로아세산 55마이크로리터를 비드에 넣습니다. 비드를 실온에서 10분 동안 배양하고 튜브 바닥을 두드려 섞어줍니다. 미니어처 원심분리기에서 30초 동안 실온에서 구슬을 회전시보시다.
평평한 팁젤 로딩 팁을 사용하여 용출된 펩티드를 새로운 튜브로 옮길 수 있습니다. 물에 0.15%의 트리플루오로아세산 45마이크로리터를 비드에 넣습니다. 튜브 의 바닥을 탭하면서 실온에서 10 분 동안 배양하여 가끔 섞습니다.
미니어처 원심분리기에서 실온에서 30초 간 구슬을 회전시보시다. 플랫 팁 젤 로딩 팁을 사용하여 두 번째 용출을 제거하고 첫 번째 용출과 결합합니다. 결합된 용출 된 펩티드를 실온에서 5 분 동안 12, 000 배 g에서 회전하여 이월하는 구슬을 펠렛하십시오.
펩티드 샘플 용액을 새로운 500 마이크로리터 튜브로 전송합니다. 10분 동안 분당 2개의 마이크로리터에서 모바일 상 A로 세척하여 풍부한 펩티드 혼합물을 C18 전열 칩에 적재하고 펩티드를 다시 탈염하는 로딩 방법을 구축한다. 펩티드가 분석 컬럼으로 옮겨지고 분당 300나노리터의 유량으로 이동상 A와 B.를 사용하여 2~3시간 그라데이션으로 체질화하는 크로마토그래피 방법을 구축하여, 80분 이상 5%의 이동상 B에서 35%의 이동상 B로 선형 그라데이션을 사용한다.
그 후, 이동상 B를 5분 동안 80%로 경사로돌린 다음 8분 동안 80%B로 유지한 후 25분 간 재평형으로 5%B로 돌아갑니다. 다음으로 데이터 종속 수집을 위한 MS 계측기 방법을 빌드합니다. 실험용으로는 M/Z 400에서 1, 500까지 MS1 전구체 이온 스캔을 설정합니다.
지속 시간을 120분으로 설정합니다. IDA 실험을 만들고 확인을 클릭합니다. 스위치 기준 탭에서 강도 임계값을 설정하여 초당 2~5~200개 사이의 충전 상태의 이온에 대한 MS/MS 스캔을 트리거합니다. 전구체 이온의 동적 제외를 60초로 설정합니다.
실험 2의 경우 MS2 스캔 범위로 MS/MS 제품 이온 스캔을 M/Z 100에서 1, 500까지 설정합니다. 매개 변수 편집을 클릭하고 충돌 에너지 확산을 5로 설정하고 고감도 제품 이온 스캔 모드를 선택합니다. 마지막으로 샘플을 자동 샘플러에 넣습니다.
샘플 큐를 제출하고 데이터 독립적 인 수집을위한 MS 계측기 방법을 구축하고 두 개의 계측기 스캔 실험을 정의하는 LC-MS / MS 수집 방법을 시작합니다. 400에서 1, 250 질량에서 MS1 전구체 이온 스캔을 수행하여 충전하고 지속 시간을 120분으로 설정합니다. 충돌 에너지 스프레드를 10으로 설정하고 축적 시간을 45밀리초로 설정한 다음 고감도 제품 이온 스캔 모드를 선택합니다.
다음으로, 64개의 가변 창 DIA SWATH 획득 체계가 포함된 텍스트 파일을 가져와 스와트 획득 창을 메서드로 채웁니다. 이 인수 방식에서, 5~90질량에서 충전 및 폭에 이르는 가변 창은 45밀리초 누적 시간으로 각각 총 64SWATH 세그먼트로 충전하기 위해 400에서 1, 250 질량의 전체 질량 범위에 걸쳐 증분 단계로 전달됩니다. MS1 축적 시간을 0.25초로 조정합니다.
함께 MS1 스캔및 64 MS2 스캔은 이제 총 3.2초의 사이클 시간을 생성합니다. 이 연구에서는, 실험 결과는 PTM 교차 대화를 검출하고 평가의 가능성을 문서화했습니다. 이 표는 워크플로의 타임라인과 필요한 샘플 및 단백질의 양을 보여줍니다.
원포트 방법은 반으로 수행될 수 있으며 이러한 대체 방법으로 샘플 수의 절반을 수행할 수 있습니다. 수정된 펩티드 영역에 대한 변형의 중앙계수는 단일 PTM 및 직렬 PTM 농축보다 원포트 방법에서 낮았다. 1pot PTM 및 단일 PTM 농축 방법을 비교하는 동안 두 수정에 대한 사이트 수준 정량화의 상관 관계 사이에 주목할 만한 차이는 보이지 않았습니다.
이 그림은 성공적인 농축에서 데이터를 표시하고 PTM 크로스 토크를 시각화하는 다중 및 상이한 아실 수정을 포함하는 펩티드에 대한 예를 보여 줍니다. 펩타이드는 하나의 리신 잔류물위에 아세틸화되었고, 다른 하나는 다른 쪽에서 간결하게 되었고, 여기서도 동일한 펩타이드가 두 리신에서 수축되었다. 이는 동일한 리신 잔류물이 두 아실레이션 그룹으로 수정될 수 있으며 해당 사이트에서 상호 대화가 발생할 가능성이 있음을 보여줍니다.
각 샘플이 동일한 양의 구슬을 포함하고 펩티드 본드 구슬을 세척할 때 실수로 비드를 흡입하지 않도록 하는 것이 필수적입니다. Spectronaut와 같은 소프트웨어 도구의 대량 분석 기반 프로파일링 및 데이터 분석은 이 절차에 따라 수행되어 PTM의 사이트 현지화를 식별, 정량화 및 수행합니다. 동시 PTM 농축과 함께 이 데이터 독립적인 인수 워크플로우는 PTM 상호 대화를 보다 효율적으로 평가하고 PTM 시그널링의 관련성에 대한 더 나은 통찰력을 제공할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.
