이 프로토콜을 사용하면 주어진 단백질의 유비퀴틴화 된 형태를 포유류 세포로부터 효율적으로 정제하여 단백질 기능을 조절하는 유비퀴틴화의 역할에 대한 연구를 용이하게 할 수 있습니다. 시험관내 정제와 비교하여 포유동물 세포에서 유비퀴틴화된 단백질의 정제는 보다 방사선학적 조건 하에서 표적 단백질의 유비퀴틴 결합 모드를 유지합니다. 3 개의 15 밀리리터 원심 분리 튜브에 1.5 밀리리터의 감소 된 혈청 배지를 추가하여 시작하십시오.
형질주입 준비가 된 플라스미드 DNA를 각 튜브에 추가하고 0.2마이크로그램의 녹색 형광 단백질 플라스미드를 추가하여 형질주입 효율을 모니터링합니다. 78 마이크로리터의 리포좀 형질주입 시약을 다른 원심분리 튜브의 4.5 밀리리터의 환원된 혈청 배지에 첨가하여 리포좀을 희석한다. 튜브를 튕겨서 완전히 섞은 다음 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오.
희석된 DNA 용액 1.5밀리리터가 들어 있는 각 튜브에 희석된 리포좀 용액 1.5밀리리터를 추가합니다. 완전히 혼합하고 플라스미드를 실온에서 최소 20분 동안 리포좀과 가교결합시킵니다. 페트리 접시에서 원래 배지를 버리고 각 접시에 환원 된 혈청 배지 9 밀리리터를 첨가하십시오.
리포좀 DNA 혼합물 3 밀리리터를 넣고 플레이트를 앞뒤로 3 번 부드럽게 흔든 다음 플레이트에 혼합물을 고르게 분배하기 위해 좌우로 3 번 혼합하여 용액을 혼합합니다. 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 세포를 5%이산화탄소로 배양합니다. 4 내지 6시간 후에 배지를 교체하고 24 내지 36시간 동안 세포를 계속 배양한다.
24 내지 36시간 후, 세포를 MG132로 최종 농도 10 마이크로몰로 4 내지 6시간 동안 처리한다. 배지를 버리고 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 2회 세척한다. 접시에 1 밀리리터의 PBS를 첨가하십시오.
깨끗한 스크레이퍼로 세포를 긁어 제거하고 세포 현탁액을 미세 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 700G에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수집하였다. 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 800마이크로리터의 얼음처럼 차가운 FLAG 용해 완충액을 각 튜브의 세포에 추가합니다.
와류 발진기 또는 피펫 건을 사용하여 세포를 혼합 한 다음 섭씨 4 도의 회전 장치에서 혼합물을 30 분 동안 배양합니다. 각 펄스가 1 초 동안 지속되는 얼음 위의 혼합물을 초음파로 처리하고 혼합물을 5-10 개의 짧은 펄스로 만듭니다. 혼합물을 섭씨 4도에서 30분 동안 40RPM의 회전 장치에서 배양합니다.
그런 다음 섭씨 4도에서 20-30 분 동안 8, 000 G에서 초음파 샘플을 원심 분리합니다. 상청액을 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 세포 추출물 80 마이크로리터를 분취하고, 20 마이크로리터의 5X SDS 로딩 완충액과 혼합한다.
샘플을 섭씨 98도에서 5 분 동안 끓입니다. 얼음에서 2 분 동안 식히고 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 이러한 샘플을 입력 그룹으로 사용하여 단백질 발현을 모니터링합니다.
다음으로, 30마이크로리터의 항-FLAG M2 항체 접합 비드를 나머지 세포 추출물에 첨가하고 섭씨 4도의 회전 장치에서 최소 4시간 또는 밤새 배양합니다. 1, 500 G에서 섭씨 4도에서 2 분 동안 원심 분리하여 비드를 수집하십시오. 얼음처럼 차가운 FLAG 용해 버퍼 1밀리리터를 비드에 넣고 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합합니다.
이 단계를 4-6회 반복한 다음 마이크로리터당 200나노그램의 최종 농도로 40마이크로리터의 FLAG 펩타이드를 비드에 추가합니다. 앞서 표시된 대로 회전기에서 2시간 동안 배양한 다음 동일한 온도에서 원심분리합니다. 상청액을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 10 마이크로 리터의 5X SDS 로딩 버퍼를 추가합니다.
혼합물을 섭씨 98도에서 5 분 동안 끓인 다음 얼음에서 2 분 동안 식힌다. 얼음처럼 차가운 PBS 1밀리리터를 셀 펠릿에 넣고 고르게 섞습니다. 세포 현탁액 100 마이크로리터를 투입된 시료로서 마이크로원심분리 튜브에 넣고 섭씨 4도에서 5분 동안 700G에서 원심분리하여 세포 펠릿을 수집하였다.
입력 샘플에 80마이크로리터의 FLAG 용해 버퍼를 추가하고 앞에서 설명한 대로 와류 발진기를 사용하여 세포를 혼합합니다. 세포를 얼음 위에서 1시간 동안 용해시킨 다음, 20 내지 30분 동안 다시 원심분리한다. 원심융합 후 상청액 80 마이크로리터를 새로운 마이크로원심분리 튜브에 분취하고, 20 마이크로리터의 5X SDS 로딩 완충액을 상청액에 첨가한다.
혼합물을 섭씨 98도에서 5-10 분 동안 끓인 다음 얼음에서 2 분 동안 식힌다. 나머지 900 마이크로리터의 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 5분 동안 700G에서 원심분리하여 세포 펠렛을 수집하였다. 세포 펠릿에 1 밀리리터의 유비퀴틴 완충액 1을 넣고 세포를 고르게 분배하기 위해 여러 번 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
용액이 더 이상 점성이 없을 때까지 얼음에 초음파의 10-20 라운드에 세포 용해물을 적용한 다음 용액을 원심 분리하십시오. 상청액을 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기고 30 마이크로 리터의 니켈 충전 수지를 상청액에 첨가합니다. 회전 장치에서 15RPM으로 4시간 동안 또는 실온에서 밤새 배양한 다음 2분 동안 원심분리합니다.
원심 융합 후, 비드를 모으고 1 밀리리터의 유비퀴틴 완충액 1을 첨가한다. 실온에서 10 분 동안 쉐이커에서 회전하면서 배양 한 다음 이전에 도시된 바와 같이 1, 500G에서 2 분 동안 다시 원심 분리합니다. 1 밀리리터의 유비퀴틴 완충액 2를 비드에 첨가하고 배양을 수행 한 후 이전에 표시된 것처럼 원심 분리하여 비드를 수집합니다.
이 단계를 한 번 반복합니다. 다음으로, 1 밀리리터의 PBS를 비드에 첨가하고 배양 및 원심 분리에 대해 동일한 절차에 따라 비드를 수집합니다. 이 단계를 다시 한 번 반복하십시오.
비드가 결합된 단백질을 실온에서 1시간 동안 0.5몰의 최종 농도로 40 마이크로리터의 이미다졸과 함께 인큐베이션하여 용리시킨다. 배양 후, 1, 500 G에서 2 분 동안 다시 원심 분리한다. 상청액을 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 10 마이크로리터의 5X SDS 로딩 버퍼를 추가합니다.
용액을 섭씨 98도에서 5 분 동안 끓인 다음 얼음에서 2 분 동안 식힌다. 샘플을 SDS-PAGE로 분해한 다음 웨스턴 블로팅을 통해 니트로셀룰로오스 막으로 옮겨 해당 항체를 사용하여 표적 단백질을 검출합니다. 화학 발광 이미징 시스템을 시작하여 웨스턴 블로팅의 신호를 감지합니다.
니트로셀룰로오스 멤브레인을 카메라 옵스큐라의 앞면이 위로 향하게 놓습니다. 피펫 건을 사용하여 멤브레인에 기판 용액을 고르게 인코딩하십시오. 마지막으로 자동 노출 절차를 선택하여 화학 발광 신호를 캡처하고 이상적인 신호가 획득 될 때까지 노출 시간을 수동으로 조정하십시오.
유비퀴틴화된 p53을 포함하는 총 p53 단백질은 비변성 조건하에서 H1299 세포로부터의 FLAG M2 비드로 면역침전시켰다. 용출액을 항 p53 및 항 헤마글루티닌 또는 항 p53 및 단일클론 항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 여기서, 조세포 추출물 또는 투입물을 항 p53 및 항 MDM2 단일클론항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다.
저분자량에서 고분자량까지 번진 밴드로 나타나는 유비퀴틴화된 p53 단백질의 신호는 MDM2가 이들 세포에서 외분비로 발현되었을 때 현저하게 증가했습니다. 이러한 결과는 유비퀴틴화된 p53 단백질이 세포로부터 효과적으로 정제되었음을 시사한다. 다음에, 세포를 변성 조건 하에서 용해시켰다.
총 세포 유비퀴틴화 단백질을 니켈 하전 수지로 끌어내린 다음, 항 p53 및 항 헤마글루티닌 모노클로날 항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 유비퀴틴화된 p53 단백질은 항 p53 항체 및 항 헤마글루티닌 항체를 사용하여 검출하였다. 여기에 조세포 추출물 또는 투입물을 항 p53 및 항 MDM2 모노클로날 항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다.
결과는 총 유비퀴틴화 단백질 수준은 변하지 않았지만 MDM2가 이들 세포에서 과발현된 후 유비퀴틴화된 p53 단백질 수준이 극적으로 증가했음을 보여주었습니다. 이는 유비퀴틴화된 p53을 함유하는 총 유비퀴틴 단백질이 변성 조건 하에서 세포 용해물로부터 효과적으로 끌어내렸음을 나타낸다. 이 절차를 시도할 때 세포 수집 전에 MG132로 세포를 처리하고 유비퀴틴화된 단백질의 정제를 위해 얼음에서 세포를 적절하게 초음파 처리하는 것을 잊지 마십시오.
