이 수정된 ATAC-seq 프로토콜은 미토콘드리아 판독을 50%에서 3% 미만으로 감소시키는 새로운 용해 완충제에 도입되어 미토콘드리아 오염이 감소하여 연구원이 시퀀싱 비용의 50% 감소로 보다 효율적인 ATAC-seq를 수행할 수 있게 합니다. 우리는 인간 1 차적인 PBMC, 인간 1 차적인 단핵구, 마우스 수지상 세포 및 흑색종 세포 주에 있는 이 새로운 ATAC-seq 프로토콜을 검증했습니다. 우리는 그것이 세포 모형의 넓은 범위에서 효과적일 것이라고 믿습니다.
세포 활성화 및 선택 프로세스 중 샘플 손실을 최소화하는 것은 ATAC-seq로 고품질 결과를 얻는 데 매우 중요합니다. 우리는 기본 실험실 장비를 사용하여 귀중한 견본에서 세포의 작은 수를 취급하는 방법을 보여줄 것입니다. 먼저 이전에 격리된 CD4+T 셀의 유리병을 37도 의 수조에서 해동하여 얼음이 녹을 때까지 해동하십시오.
그런 다음 세포를 15밀리리터 원내 튜브로 부드럽게 이송하여 9밀리리터의 완전 RPMI를 함유하고 있습니다. 세포를 1, 500배, 섭씨 4도에서 6분간 원심분리합니다. 그런 다음 상체를 버리고 완전한 RPMI의 2 밀리리터에서 펠릿을 부드럽게 다시 놓습니다.
원심분리를 반복한 후, 상체를 버리고, 완전한 RPMI의 0.5 밀리리터에서 세포를 부드럽게 재보페한다. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다. 완전한 RPMI를 사용하여, 96웰 의 둥근 바닥 플레이트의 웰 당 200 마이크로 리터에 플레이트 50, 000 CD4 +셀에 셀 서스펜션 밀도를 조정합니다.
그런 다음, 자기 구슬을 준비하기 위해, 1.5 밀리리터 튜브에 ATAC-seq 샘플 당 인간 T-액티베이터 CD3/CD28 구슬의 알리쿼트 12.5 마이크로리터. 튜브에 1x PBS1 밀리리터를 넣고 자석에 1분간 놓아 구슬을 씻습니다. 클리어 상체를 조심스럽게 제거하고 버리고 자석에서 튜브를 제거합니다.
ATAC-seq 샘플당 완전한 RPMI의 13 마이크로리터에서 구슬을 재보선합니다. 조정된 농도로 CD4+T 세포를 활성화하려면 15밀리리터 원컬 튜브에서 완전한 RPMI 배지의 2.1 밀리리터에서 500, 000 세포를 수집합니다. 인간 T-액티베이터 구슬 12.5 마이크로리터를 넣고, 이전 단계에서 준비하고 세척한 후 튜브를 반전시켜 부드럽게 섞습니다.
그런 다음 구슬로 세포를 멸균 저수지로 부드럽게 옮기십시오. 다중 채널 파이펫을 사용하여, 라운드 하단 96 웰 플레이트의 웰 당 구슬이있는 세포의 200 마이크로 리터를 플레이트, 37도 섭씨, 48 시간 동안 5 %CO2 인큐베이터에서 배양. 완전한 인큐베이션 후, 접시를 423배 G, 실온으로 8분간 원심분리합니다.
비드 손실을 확인하기 위해 각 우물에서 100 마이크로 리터의 매체를 제거하고 폐기하기 전에 원문 튜브에서 수집합니다. 그런 다음 나머지 100 마이크로 리터의 세포 펠릿을 다시 중단하고 1.5 밀리리터 튜브에서 모든 것을 수집합니다. CD4+세포를 격리하려면 미리 세척된 CD4 컨쥬게이드 구슬 50마이크로리터를 500개, 000셀을 완전한 RPMI의 1밀리리터에 넣고 혼합을 반전시다.
섭씨 4도에서 20분 간 배양하고, 6분마다 손으로 쓸어넘기면 섞어보겠습니다. 상류체가 명확해질 때까지 2분간 자석에 튜브를 놓고 제거하고 버립니다. 자석에서 튜브를 제거합니다.
PBS의 1밀리리터와 2%FCS로 비드 바운드 셀을 세척하고 튜브를 1분 동안 자석에 다시 놓습니다. 명확한 상체를 버리고 총 세 번의 세 가지 세정을 위해이 과정을 반복합니다. 마지막 세척 후, 1 분 동안 자석에 튜브를 배치합니다.
그것을 제거하고 상체를 버리고 펠릿을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 핵 절연을 수행하기 위해, 차가운 용해 완충제의 50 마이크로 리터에서 구슬과 세포를 재연하고, 원심분리기는 섭씨 4도인 500G에서 즉시 10분 동안 재연한다. 상체를 제거하고 폐기합니다.
트랜스포지아제 반응을 수행하기 위해, Tn5 트랜스포지아제 믹스의 50 마이크로리터로 격리된 핵 펠릿을 재보종한다. 온도 37도에서 30분 동안 열순환기를 배양하고 뚜껑은 섭씨 40도로 설정된 다음 완료되면 섭씨 4도에서 유지하십시오. 열사이클링 직후 빠른 벤치 탑 원심분리기 스핀다운을 수행합니다.
제품에서 구슬을 제거하기 위해 자석에 튜브를 1 분 동안 놓습니다. 자석에서 튜브를 제거하지 않고 명확한 상체를 DNA 정화 컬럼으로 옮기십시오. PB 버퍼 250 마이크로리터로 한 번, PE 버퍼 750 마이크로리터로 두 번 컬럼을 세척합니다.
그런 다음 용출 버퍼 10 마이크로리터를 추가하여 샘플을 엘로우트합니다. 뉴클레아제없는 PCR 튜브에 초기 PCR 증폭 반응을 설정합니다. PCR 튜브를 열순환기에 넣고 PCR 증폭 프로그램을 실행합니다.
그런 다음 원고에 설명된 대로 PCR 반응의 나머지 45 마이크로리터의 최종 PCR 증폭을 완료합니다. PCR 튜브를 열순환기에 배치하고 프로그램을 실행합니다. 완전한 증폭 후 제조업체의 프로토콜에 따라 PCR 정리 키트를 사용하여 라이브러리를 정수하여 용출 버퍼의 25 마이크로리터를 용출합니다.
준비된 라이브러리를 차세대 시퀀서에 시퀀서에 시퀀서당 평균 읽기 깊이 4,200만 개에 시퀀스합니다. 이 향상된 ATAC-seq 프로토콜은 시퀀싱을 위해 마이크로리터 당 1나노그램 이상의 최종 라이브러리를 생성했습니다. 품질 관리는 200과 1 사이의 DNA 단편을 보여주었으며, 000 개의 기본 쌍, 그리고 이러한 고품질 라이브러리와 함께 추가 시퀀싱이 수행되었다.
이 프로토콜에 따라 준비된 라이브러리는 3%의 미토콘드리아 오염만 을 보였다. 사용 가능한 읽기의 높은 비율은 생물학적 복제에 걸쳐 충분히 일정합니다. 이 프로토콜은 생물학적 복제뿐만 아니라 기술적 복제에 걸쳐 매우 재현 가능한 결과를 제공했습니다.
또한 이 프로토콜은 이전에 설명한 대로 1주일 이상이 아닌 48시간이 걸렸으며, 그 결과 재현 가능한 시퀀싱 결과에 의해 입증된 일관되고 효율적인 활성화가 이루어졌습니다. 또한 분석 파이프라인에서 예측된 ATAC-seq 피크를 정확하게 호출했습니다. 시퀀싱 결과 분석은 인간 T 세포 활성화 도중 크로마틴 상태에 있는 명확한 변경을 밝혔습니다.
개방 된 크로마틴의 차별화 접근 영역은 활성화 후 6 개의 샘플과 48 시간 사이에 확인되었습니다. 핵 리시스 반응이 냉기 시약 및 재료로 수행되어 그대로 핵의 회복을 극대화하도록 하십시오. 우리의 변형 된 핵 리시스 버퍼는 세포에 온화하고, 미토콘드리아 DNA를 오염 최소화.
우리는 또한 단 하나 핵 ATAC-seq에 적용되는 이 수정한 용해 완충을 기대합니다. 우리는 이 프로토콜이 연구원이 감소된 비용으로 더 높은 품질의 ATAC-seq 데이터를 생성할 수 있다는 것을 알고 있으며, 후성 유전학 분야를 전달하는 데 도움이 됩니다. 이 프로토콜은 간단하고 빠르며 위험한 시약이나 계측기를 필요로 하지 않으므로 ATAC-seq에 새로 액세스할 수 있습니다.
