여기서는 일반적인 6개의 벽 배양판을 사용하여 전기 자극챔버를 구축하는 방법과 중간엽 줄기 세포에서 골성 분화를 자극하기 위해 이를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 챔버는 쉽게 빌드 비용이 많이 들며 여러 실험에서 재사용할 수 있습니다. 우리의 챔버에서 전기 자극으로 사전 치료 된 후, 중간 엽 줄기 세포뼈 조직 공학 치료에 있는 결과를 향상 하기 위해 사용할 수 있습니다.
이 챔버는 또한 다른 세포 유형 및 이동 같은 전기 에 민감한 세포 거동을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다., 증식, 막 잠재력의 변화, 세포 사 멸 증, 그리고 신중 한 첨부 파일. 6개의 웰 플레이트 뚜껑에서 마크한 다음 직경 25mm의 두 개의 1mm 구멍을 각각 6개의 우물의 바깥쪽 가장자리 근처에서 드릴링합니다. 다음으로 백금 와이어를 12 5센티미터 길이의 섹션으로 자른다.
5센티미터 의 각 부분을 L"모양으로 수동으로 구부리면 한쪽 끝은 3센티미터, 다른 한쪽은 길이가 2센티미터입니다. 그런 다음 은 코팅 와이어를 두 개의 35센티미터 길이로 자른다. 플래티넘 와이어의 긴 구부러진 끝을 드릴 구멍에 삽입하여 뚜껑 바깥쪽에서 1~2밀리미터돌출됩니다.
집게를 사용하여 구부립니다. 그 후, 매우 전도성 접착제로 뚜껑 구멍에 백금 와이어를 고정하고 약 6 시간 동안 건조하게 둡니다. 음극을 준비하려면 뚜껑에서 은코팅 와이어 중 하나로 튀어나온 6개의 플래티넘 와이어의 팁을 납땜합니다.
양극을 준비하려면 나머지 6개의 플래티넘 와이어를 다른 실버 코팅 와이어로 납땜합니다. 이어서, 6개의 양극 음극 백금 전극 쌍 의 각 회로에 LED를 추가하여 기능을 확인합니다. 각 LED 아래에 검은 절연 테이프를 배치하여 배양 판의 세포가 LED 조명에 노출되는 것을 방지합니다.
다음으로 와이어 단말 블록 커넥터를 6웰 플레이트 뚜껑의 왼쪽 상단 모서리에 붙이고 은 코팅 된 와이어를 입력 단자와 연결합니다. 그런 다음, 첫 번째 뚜껑의 터미널 블록 커넥터를 수용하기 위해 두 번째 6 웰 플레이트 뚜껑의 왼쪽 상단 모서리에서 20mm의 사각형 섹션을 잘라냅니다. 두 번째 뚜껑을 장착한 첫 번째 뚜껑을 덮고 접착제 테이프로 테이프를 붙입니다.
두 개의 표준 절연 구리 와이어의 한쪽 끝을 와이어 커넥터의 출력 단말에 연결하고 다른 쪽 끝을 바나나 남성 커넥터에 연결합니다. 전면 패널의 ON-OFF 버튼을 눌러 전원 공급 장치를 켭니다. 버튼을 하나 눌러 채널 하나를 활성화합니다.
그 후 버튼을 4번 눌러 전압을 설정합니다. 하중 출력을 2.5볼트로 설정합니다. 그런 다음 Enter를 누릅니다.
당일 세포는 E 줄기로 처리되고, 전극을 70%에탄올 용액으로 30분 동안 살균한다. 그런 다음 안전 캐비닛에서 UV 빛 아래에서 30 분 동안 건조하십시오. 라미나르 플로우 후드에서 전극이 장착된 뚜껑을 가진 배양된 MSC를 함유한 6웰 플레이트를 덮어 전극이 매체에 완전히 침수되도록 한다.
그런 다음, 커버된 6웰 플레이트를 셀로 인큐베이터로 옮기고 전선을 전원 공급 장치에 연결합니다. 다음으로 전원 공급 장치를 2.5볼트 하중 출력으로 설정하고 세포를 E 줄기로 1시간 동안 처리합니다. 자극 후 전원 공급 장치를 분리하고 인큐베이터에서 E 줄기 챔버를 제거합니다.
멸균 조건에서, 표준 6 웰 플레이트 뚜껑, 전극장착 뚜껑을 교체하십시오. 그 후 세포를 인큐베이터로 돌려보내 하룻밤 동안 둡니다. 먼저 PBS로 전극을 청소한 다음 70% 에탄올 용액으로 청소합니다.
그런 다음, 전극 표면에서 축적 된 부식 제품을 미세 한 사포로 청소하십시오. 6일 연속 E줄기 치료를 반복한다. 4일째, 전기 자극을 적용하기 전, 멸균 조건하에서, 배지 1.5 밀리리터를 흡입하고 1.5밀리리터의 사전 따뜻하고 신선한 골분화 분화 매체로 대체하여 배양 배지를 변경한다.
7일 연속 전기자극을 적용한 후, 3~4일마다 배지를 교환하여 7일 간 배양시 세포를 유지한다. 치료가 완료되면 현미경으로 세포 형태 변화를 분석하십시오. MSC 골성 분화에 대한 전기 자극의 효과를 평가하기 위해 다른 곳에서 설명된 바와 같이 칼슘 증착, 알칼리인포스파아제 활성 및 골조성 마커 유전자 발현을 측정합니다.
MSC 골성 분화에 대한 전기 자극의 밀리미터당 100 밀리볼트의 효과를 평가하기 위해, 3, 7, 14일 및 비처리 된 세포를 전기 자극으로 처리된 세포는 형태학적 변화 및 칼슘 증착을 평가하여 배양 14일째에 분석하였다. 세포 형태와 칼슘 침전의 중요한 변화는 7 일과 14 일 동안 전기 자극으로 처리 된 세포에서 볼 수 있었습니다. 골성 마커 유전자 발현 변화에 대한 상세한 분석은 문화의 3일, 7일 및 14일에 수행되었다.
배양 7일째에 RunX2 발현은 7일 동안 전기 자극으로 처리된 세포에서 현저히 높았다. Colla1 발현은 배양의 14일째에 측정된 7일 동안 처리된 세포에서 상당히 높았습니다. 골테오폰틴의 발현은 배양의 3일, 7일, 14일 동안 전기자극세포에서 현저히 증가하였다.
Osterix 발현은 항상 제어 세포에 결석했으며 전기 자극에 노출된 세포에서 7 일 및 14 일 배양에서만 볼 수 있었습니다. 전기 자극 챔버는 비교적 쉽게 구축할 수 있습니다. 그러나 백금 와이어를 취급할 때, 전극을 청소하고 살균할 때도 특별한 주의를 기울여야 합니다.
우리 챔버에서 전기로 전처리된 세포는 단독으로 또는 비계 재료에 앉은 동물 모델에 이식되어 전기 자극의 긍정적 인 효과가 체외에서 지속되는 방법을 연구할 수 있습니다. 이 기술은 전기 자극이 세포 기능을 조절하는 메커니즘을 연구하는 간단하면서도 강력한 도구를 제공합니다. 이 지식은 재생 의학 세포에서 사용할 수 있습니다.
