향상된 효모 1 하이브리드 소의 목표는 관심의 DNA 순서에 결합하는 전사 요인의 집합을 확인하는 것입니다. 이 기술의 장점은 향상된 효모 원 하이브리드 아사약이 단일 실험에서 1000개 이상의 전사 인자를 평가할 수 있다는 것입니다. 반대로, 크로마틴 면역 침전은 한 번에 하나의 전사 인자를 평가합니다.
이 방법은 기능적 유전체학이 유전자 프로모터 및 강화제에 결합하는 전사 인자의 레퍼토리를 식별하고 비코딩 이체에 결합하는 변경된 전사 인자를 식별하는 핵심 도구를 구성합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 Xing Liu 포스트 독이 될 것입니다. 얼음에 TF 먹이 배열로 효모 글리세롤 스톡 플레이트를 해동.
12 채널 파이펫을 사용하여 효모를 다시 중단하고 1~ 3분 이내에 다음 단계로 진행합니다. Sc 마이너스 트립토판 직사각형 플레이트로 효모를 발견하려면 고밀도 어레이 로봇을 사용하여 멀티웰 96 플레이트를 소스로, 96개의 한천판을 대상으로, 96개의 긴 핀 패드를 선택합니다. 핀 패드는 재사용이 가능하지 않으며 폐기해야 합니다.
스팟 많은 프로그램을 선택하여 96웰 플레이트당 두 개의 복사본을 만듭니다. 냉동 주식의 백 오염을 피하기 위해 재활용 또는 재방문 옵션을 사용하지 마십시오. 또한, 효모를 혼합하는 소스에서 위아래로 소용돌이 옵션을 선택합니다.
플레이트를 어디에 배치하고 로봇이 트립토판 직사각형 플레이트를 뺀 Sc로 효모를 발견할 수 있도록 하는 장소와 장소에 대한 지침을 따르십시오. 점박이 배열을 가방에 넣고 2~3일 동안 섭씨 30도에서 한천 쪽을 배양합니다. Sc 마이너스 트립토판 직사각형 플레이트에서 384개의 콜로니 어레이를 생성하려면 96개의 한천판을 소스로, 384개의 한마판과 96개의 짧은 핀 패드를 선택한다.
그런 다음 1:4 배열 단일 소스 프로그램을 선택합니다. 이런 식으로, 4 개의 96 식민지 플레이트는 하나의 384 식민지 판으로 통합됩니다. 다른 플레이트 간의 오염을 피하기 위해 재활용 또는 재방문 옵션을 사용하지 마십시오.
플레이트를 가방에 넣고 2 일 동안 30섭씨30도에서 발견 된 384 콜로니 어레이 천을 배양하십시오. Sc 마이너스 트립토판 직사각형 플레이트에서 1536개의 콜로니 어레이를 생성하려면 384개의 한천판을 소스로, 1536개의 한천판을 대상으로, 384개의 짧은 핀 패드를 선택한다. 그런 다음 1:4 분석 단일 소스 프로그램을 선택합니다.
목표는 각 식민지를 네 개의 식민지로 복사하여 네 배의 식민지를 얻는 것입니다. 각 식민지를 4번 복사하는 것과 관련이 있기 때문에 재활용 및 재방문 옵션을 사용합니다. 로봇의 지시에 따라 로봇이 3일 동안 섭씨 30도에서 발견된 1536콜로니 어레이 천을 배양하고 배양하기 전에 효모를 접시에 집어 넣을 수 있도록 하십시오.
Sc 마이너스 트립토판 직사각형 플레이트의 1536 콜로니 어레이를 증폭하려면 1536개의 한천 판을 소스로, 1536개의 한천판을 대상으로, 1536개의 짧은 핀 패드를 선택한다. 복제 많은 프로그램을 선택하여 3~4개의 복사본을 복제합니다. 재활용 및 재방문 옵션을 사용하지만 교차 오염을 방지하기 위해 어레이의 다른 플레이트로 전환 할 때 패드를 던져.
로봇이 트립토판 직사각형 플레이트를 뺀 Sc의 1536 콜로니 어레이를 증폭할 수 있도록 합니다. 마지막으로, 접시를 가방에 넣고 3 일 동안 30섭씨에서 발견 된 1536 콜로니 어레이 화창 측을 배양하여 짝짓기 단계에 사용합니다. 짝짓기를위한 DNA 미끼 변형 잔디를 준비하려면 Sc 마이너스 우라실과 히스티딘 플레이트에 DNA 효모 미끼 균주를 발견하고 섭씨 30도에서 3 일 동안 성장하십시오.
효모를 15센티미터 Sc로 줄이면 멸균 이쑤시개를 사용하여 우라실과 히스티딘 플레이트를 사용하여 각 플레이트가 12~16가지 균주에 맞도록 합니다. 어느 날 섭씨 30도에서 접시를 배양하십시오. 다음 날, 효모를 15센티미터 Sc로 줄이며, 각 플레이트가 4가지 균주에 맞을 수 있도록 멸균 이쑤시개를 사용하여 우라실과 히스티딘 플레이트를 빼고 있습니다.
섭씨 30도에서 하루 동안 접시를 배양하십시오. 인큐베이션후 멸균 이쑤시개를 사용하여 효모를 긁어 내고 한천을 긁지 않도록하십시오. 효모를 멸균 수분 500마이크로리터가 있는 1.5 밀리리터 튜브에 넣습니다.
이제 10~15개의 멸균 유리 구슬과 효모 서스펜션을 YAPD 직사각형 플레이트에 넣습니다. 효모가 접시 전체에 퍼지도록 1 분 동안 모든 방향으로 완전히 흔들어줍니다. 접시를 즉시 반전시키고 비드가 뚜껑으로 이동하도록 누릅니다.
구슬을 제거하고 재활용합니다. 접시를 가방에 넣고 섭씨 30도에서 1~2일 동안 한천 쪽을 배양합니다. 그런 다음 짝짓기 단계로 진행합니다.
효모 DNA 미끼 및 TF 어레이 균주를 결합하려면 TF 어레이를 로봇과 YAPD 직사각형 플레이트로 옮기습니다. 1536 개의 한천판을 소스와 대상으로 선택하고 1536 개의 짧은 핀 패드를 선택합니다. 많은 복제 프로그램을 선택합니다.
4개의 소스 플레이트와 재활용 및 재방문 옵션을 선택합니다. 각 TF 어레이 플레이트는 3 ~4 개의 YAPD 플레이트를 전송하는 데 사용할 수 있습니다. 짝짓기에 사용되는 TF 어레이 플레이트는 2~3일 이어야 하지만 짝짓기가 비효율적이기 때문에 더 이상 그렇지 않습니다.
DNA 미끼 균주의 잔디를 이미 TF 어레이가 들어 있는 YAPD 플레이트로 옮기려면 1536개의 한마판을 소스와 표적및 1536개의 짧은 핀 패드로 선택한다. 많은 복제 프로그램을 선택합니다. 반경이 약 0.6밀리미터인 소스에서 임의 오프셋을 사용하여 동일한 지점에서 효모를 복용하지 않도록 하고 대상에 혼합을 선택하여 효모 균주 간의 접촉을 용이하게 합니다.
DNA 미끼 균주를 포함하는 잔디를 소스로 사용하고, 접시를 포장하고 하루 동안 30섭씨에서 그들을 식기 측을 배양하기 전에 대상으로 발견 된 TF 배열을 포함하는 YAPD 플레이트. 디플로이드 효모의 선택을 위해, 1536 개의 한마판을 소스와 대상으로 선택하고 1536 개의 짧은 핀 패드를 선택합니다. 복제 프로그램을 선택합니다.
소스와 대상에서 믹스를 선택합니다. 로봇이 TAPD 플레이트에서 Sc 마이너스 우라실 및 트립토판 플레이트로 메이트 효모를 전송한 후 접시를 포장하고 2~3일 동안 섭씨 30도에서 식기 쪽을 배양할 수 있도록 합니다. 이제 1536개의 한고판을 소스와 대상 및 1536 개의 짧은 핀 패드로 선택합니다.
복제 프로그램을 선택합니다. Sc 마이너스 우라실및 트립토판 플레이트에서 디플로이드 효모를 로봇을 사용하여 플레이트를 포함하는 레딩 아웃 직사각형 3-AT 및 X-gal으로 옮깁니다. 접시를 가방에 넣고 최대 7일 동안 섭씨 30도까지 한천 쪽을 배양합니다.
배경 기자 활동이 높은 DNA 미끼 균주의 경우 2 일, 3 및 4 일에 사진을 찍습니다. 그렇지 않으면 4 일과 7 일에 사진을 찍습니다. TF 어레이 플레이트를 실온에서 유지하고 7일 후에 다시 복사하여 새로운 스크리닝을 할 수 있습니다.
향상된 효모 원 하이브리드 분석서를 사용하여 얻을 수 있는 결과의 유형을 설명하기 위해 CCL15 및 IL17F 유전자의 발기인 영역은 1086개의 인간 TFs배열에 대해 선별되었다. CCL15 프로모터는 상호 작용, 심지어 약한 것들조차 쉽게 검출될 수 있는 비 자동 활성 DNA 미끼의 예입니다. IL17F 프로모터는 일부 상호 작용을 감지할 수 있는 고르지 않은 배경 리포터 활동을 가진 자동 활성 DNA 미끼의 예이며, 여러 TF의 경우 리포터 활동이 배경보다 높은지 확실하지 않습니다.
향상된 효모 한 하이브리드 어필을 수행할 때 발생할 수 있는 몇 가지 문제가 있습니다. 이 경우 식민지가 너무 작고 양도하지 못했습니다. 일반적으로 TF 먹이 식민지의 약 95%가 정상적인 성장을 나타낸다.
이 예에서는, 플레이트의 일부에 효모 성장이 없다. 이 문제는 일반적으로 1536 핀 패드가 DNA 미끼 변형 잔디, TF 어레이 또는 짝짓기 플레이트에서 효모와 접촉하지 못하는 경우 짝짓기 단계에서의 실패와 관련이 있다. 이 두 예제에서는 상호 작용이 검색되지 않습니다.
이 문제는 종종 리포터 유전자, 특히 LacZ, 또는 상호 작용을 마스크 너무 높은 자동 활성에 의도하지 않은 돌연변이를 활성화하는 것과 관련이 있습니다. 이 경우 플레이트는 세균 오염과 관련된 무작위 파란색 반점을 제공합니다. 고려해야 할 가장 중요한 것은 적절한 플레이트 준비입니다.
모든 후속 단계가 이에 따라 달라지기 때문에 모든 구성 요소가 추가되고 한천 높이가 균일하게 되는지 확인합니다. 대부분의 시약은 위험하지 않지만 샘플과 플레이트의 오염을 피하기 위해 항상 장갑을 착용하는 것이 중요합니다. 임의의 DNA 결합 분석과 마찬가지로, 기자 분석, 전사 인자 녹다운 또는 녹아웃과 같은 기능적 분석을 사용하여 확인된 상호 작용을 검증한 다음 표적 유전자의 발현을 측정하는 것이 중요하다.
이 방법은 비코딩 질병 관련 이체에 대체 결합을 가진 전사 인자뿐만 아니라 특정 생물학적 과정에 관련된 유전자를 조절하는 전사 인자의 식별을 허용했습니다.
