우리는 생물학을 연구하기 위해 심각한 해충 Tortrix 질량을 사용하는 대량 사육, 관찰 및 분자 연구에 대한 근본적이지만 수요가 많은 질량을 제시합니다. 지금까지 곤충 알의 구조는 추가 분석을 방해했습니다. 특히, 우리는 모성 분비로 덮인 얇고 부드럽고 깨지기 쉬운 알에 대한 연구를 가능하게했습니다.
tortrix에 대한 추가 연구, 다른 곤충 및 기타 택시를 시도하는 데 적용 할 수있는 간단한 기술이 있습니다. Matra 라인을 구축하기 위해 파라핀 종이 조각으로 120 밀리리터 플라스틱 컵에 여성과 남성 두 마리를 넣는 것으로 시작하십시오. 대량 사육을 위해 Grater를 사용하여 약 60 그램의 인공 식단을 슬라이스하십시오.
성숙한 배아로 채워진 계란 덩어리를 플라스틱 용기의 얇게 썬 인공 식단에 놓습니다. 얇게 썬 식단으로 달걀 덩어리에 파라핀 종이를 놓습니다. 섭씨 25도에서 짝짓기를 위해 플라스틱 상자에 남성 15 명과 여성 10 명을 넣으십시오.
다섯 일에서 칠일마다 알을 모으고 각 세대마다 대량 사육 단계를 반복하십시오. 달걀 덩어리를 1.2% 차아염소산나트륨 수용액 1000마이크로리터에 담그거나 1000마이크로리터의 오몰수산화칼륨 수용액을 넣고 30분 동안 담가 계란을 분리한다. 분리 된 계란을 1000 마이크로 리터의 PBSt로 씻으십시오.
계란을 100 % 헵탄 500 마이크로 리터와 4 % 파라 포름 알데히드 PBSt 용액 500 마이크로 리터의 부피 혼합물에 담그십시오. 와류 혼합기를 사용하여 분당 1500회 회전으로 10분 동안 혼합한다. 계란을 100 % 헵탄 500 마이크로 리터와 100 % 메탄올 500 마이크로 리터의 혼합물에 담그십시오.
분당 1500회 회전으로 10분 동안 혼합합니다. 100 % 메탄올 1000 마이크로 리터로 계란을 두 번 씻고 섭씨 4도에서 100 % 메탄올로 보관하십시오. 계란을 99 % 70 % 및 50 % 에탄올 및 PBSt에 순차적으로 담그고 친수화를 위해 각각 5 분 동안 담그십시오.
PBSt로 달걀을 씻으십시오. 계란을 밀리리터 DAPI 용액 당 하나의 마이크로 그램에 다섯 분 동안 담근 다음 PBS로 계란을 두 번 씻으십시오. 계란을 1.25 % 락틱, 아세트산 또는 CN 용액 20 마이크로 리터에 담그고 핵이 화려한 붉은 색을 나타낼 때까지 헤테로 크로마틴을 시각화하십시오.
피펫을 사용하여 얼룩진 달걀을 유리 슬라이드로 옮긴 다음 퇴색 방지 시약과 커버 유리로 동봉하십시오. 포셉을 사용하여 페레이트, 아모나그네타마 및 아독소피에스 혼마이 유충을 계란 덩어리에서 추출합니다. 유리 슬라이드에서 애벌레를 해부하십시오.
조직을 100% 메탄올에 99.7%금욕산 1~세 개를 혼합하여 5분 동안 고정시킨다. 핵이 염색 될 때까지 1.25 중량 %의 lactic, ascetic, 또는 CN 용액을 가진 사람들을 얼룩지게하십시오. 현미경으로 여성에 대한 헤테로 크로마틴의 존재 또는 남성의 부재를 관찰하여 각 표본의 성별을 결정하십시오.
성별로 결정된 페레이트 유충으로부터 DNA와 RNA를 추출하기 위해, 12마리의 성별로 결정된 수컷 또는 암컷 페레이트 유충을 풀링하고, 세포 용해 완충액 또는 RNA 추출 시약을 하나의 1.5 밀리리터 튜브에 첨가한다. 고정, 투과화 및 염색 단계는 DAPI 용액으로 핵을 시각화 할 수 있습니다. 해부 된 페레이트 유충을 사용한 락틱, 금욕 또는 CN 염색은 암컷이 점으로 헤테로 크로마틴을 나타내지 만 수컷은 헤테로 크로마틴이 부족하다는 것을 밝혀 냈습니다.
스핀 컬럼을 사용하는 변형된 프로토콜은 1.9 내지 2.1의 260 내지 200 비율 및 260 내지 280 비율 1.9 내지 2.3의 비로 900 내지 1500 나노그램의 생성물을 생산하는 RNA의 품질을 향상시켰다. 변형된 프로토콜에 대한 RNA 농도 비율은 1.2 미만이었으며, 차세대 시퀀싱을 위한 품질 요건을 충족시켰다. 변형된 프로토콜을 사용하여 결정성 페레이트 유충으로부터 추출된 RNA의 온전성을 마이크로칩 전기영동을 이용하여 확인하였다.
준비된 라이브러리는 높은 Q 30 점수 판독을 산출하는 것을 확인하였다. 우리의 메시지는 기본적인 곤충 연구와 해충 도구에 기여합니다. 또한, 우리의 프로토콜은 배아 발생 동안 효과적인 화학 살충제 또는 세포 간 미생물을 평가하는 데 사용될 가능성이 있습니다.
