TO와 TD는 JSPS KAKENHI 교부금 번호 19H02970 및 20H02999에 의해 각각 지원되었다.

1. 실험실 식민지의 유지 보수
<ol><li>야생형 및 돌연변이 집단의 유지를 위해 일반 인공 어류 식품이 있는 대형 플라스틱 용기(460mm x 360mm x 170mm)를 사용하고, 상단에 환기 구멍이 있는 플라스틱 컵의 물, 곤충을 숨기기 위한 접힌 종이, 계란을 낳을 수 있는 겹겹이 있는면(그림 2A)을사용한다. 모든 T. 국산 배양을 37°C 인큐베이터 내부에 보관하고 각 용기 내부에 상대 습도(RH)를 60%-80%로 설정합니다. 참고: T. 국산은 대기(11)로부터수증기를 흡수하기 때문에 직접 수분 공급이 필요하지 않습니다. 적절한 RH는 상단에 환기 구멍을 포함하는 플라스틱 컵에서 수증기의 존재 또는 각 용기 내부의 뚜껑이없는 컵에서 유지된다. 문화가 포함된 전체 인큐베이터 내부에 가습기를 가습할 필요가 없습니다. 이 프로토콜에 기재된 조건하에서 각 발달 단계의 대략적인 지속 시간은 도 1에도시된다. 개발 속도는 온도 및/또는 RH12를변경하여 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>주기적으로 음식을 추가합니다. 물이 마르기 전에 물을 넣습니다.</li>
	<li>성인이 더러운 환경 및 / 또는 조밀 한 인구에 계란을 누워 중지 주어진 적어도 3 개월마다 새로운 깨끗한 용기에 인구를 전송 (토론참조).</li>
</ol>2. 계란 수집 및 미세 주입
<ol><li>가이드 RNA(gRNA) 설계<ol>
<li>각 요구 대상에 대한 gRNA 서열을 설계하고 가능한 오프 타겟 인식 부위를 확인하기 위해 게놈 어셈블리에 대한 gRNA 서열을 폭발한다.</li>
		<li>제조업체의 지침8에따라 gRNA를 합성하고 정화합니다. 참고: 예를 들어, ATP 결합 카세트 수송기 백색 유전자를 표적으로 하는 경우, 20bp 표적 서열이 설계되었고 2개의 합성 DNA 올리고뉴클레오티드 5'-TAATACGACTCACTATAGTGTGTGTGTGTGTGGAC-3' 및 5'-TTCTAGCTCTAAAAAAAAAAAAACACACCCCCCCCCACAACAACACTAACAACACTAACACTAACAACACTAACACTAACAACACTAACACTAACAACACTAAACACTAACACTAAACACTAAACACTATAAACACTAAACACTAAACAACACTATAAACAACACTATAAACAACACTAAACAACACTAAACACTAAACACTAAACACTAAACACTAACACTAAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAAACACTAACACTATAAACACTAAACACTAACACTATAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTA DNA 템플릿은 PCR 증폭에 이어 이 두 개의 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 제조되었으며 gRNA는 T7 RNA 폴리머라제로 템플릿으로부터 전사된 시험관내이다.</li>
	</ol></li>
	<li>계란 컬렉션 식민지 준비<ol>
<li>약 20명의 남성과 20명의 여성 성인을 중간 크기의 용기(200mm x 150mm x 90mm)에 음식, 급수, 접힌 종이, 달걀 누워를 위한 작은 층면(그림2B)으로옮긴다.</li>
		<li>게놈 편집에 사용되는 짧은 기간에 많은 수의 단계적 배아를 얻기 위해 여러 식민지를 설정합니다. 참고: 약 20~40개의 알이 37°C에서 8시간 후에 식민지에서 수집될 것으로 예상됩니다. 그것은 일반적으로 새로운 환경에 적응 때문에, 알을 누워 시작하는 전송 성인에 대한 몇 일이 걸립니다.</li>
	</ol></li>
	<li>주입 당일, 용기 내부의 면화를 새로운 면으로 교체하십시오.</li>
	<li>일반 76mm x 26mm 유리 슬라이드에 76mm x 5mm 양면 테이프를 놓습니다.</li>
	<li>8시간 후, 집게를 사용하여 층을 분리하여 층면에서 계란을 수집합니다.</li>
	<li>젖은 페인트 브러시를 사용하여 양면 테이프에 계란을 정렬하고 계란 사이의 2mm 거리를 유지합니다. 모든 계란은 계란의 세로 축이 주사 측에 직면할 수 있도록 지향되어야 한다(그림 3A). 주사 중에 단단히 들고 페인트 브러시로 계란을 부드럽게 누릅니다. 참고 : 이 프로토콜에서 곰팡이는 습하고 따뜻한 상태에서 손상된 주입 된 계란에서 빠르게 자랍니다. 교차 오염과 곰팡이의 확장을 방지하기 위해 계란 사이의 거리를 유지하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>gRNA와 Cas9 단백질을 각각 100 ng/μL 및 500 ng/μL의 최종 농도로 혼합합니다. 희석을 위해 증류수를 사용합니다. 리보뉴클레오단백질 복합체 형성을 촉진하고 얼음에 혼합을 유지하기 위해 실온에서 10 분 동안 믹스를 배양하십시오. 참고: 1% 최종 농도에서 중성 적색을 주입된 양을 모니터링하기 위해 주입 용액에 첨가될 수 있다.</li>
	<li>마이크로 로더가 있는 유리 주입 모세관에 gRNA/Cas9 용액의 2 μL을 적재합니다. 주입 전에 용액에 기포가 없는지 확인하십시오. 필요한 경우 바늘을 눌러 거품을 제거합니다. 참고:이 실험에서 기성바늘은 미세한 바늘 끝(도3B)을얻기 위해 사용된다. 비슷한 모양의 수제 바늘을 대신 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>이전에 gRNA/Cas9 용액으로 로드된 유리 사출 모세관을 조작기가 장착된 홀더에 고정하고 홀더를 전자 마이크로인젝터에 연결합니다.</li>
	<li>일련의 주사(도 3C에적합한 바늘의 예)를 통해 막힘과 더 나은 내구성을 얻기 위해 집게로 약간 분해하여 바늘 팁의 모양을 최적화합니다. 참고: 막힌 경우 바늘을 바꾸는 것이 좋습니다. 그것은 집게와 함께 다시 깨진 경우 동일한 바늘주입을 계속 할 수 있습니다., 하지만 넓은 팁 더 많은 계란 손상에 이르게 하 고 그들의 생존율을 낮춥니다. T. 국산 계란은 부드럽고 깨지기 쉬운, 미세 한 바늘 팁을 유지 하는 것은 주입 후 높은 생존율을 가지고 에 대 한 열쇠.</li>
	<li>계란의 세로 축의 중간점에 바늘을 삽입하고 약간의 양의 용액을 주입하십시오(주사량에 대한 참조를 위한 도 3D-H 참조). 바늘 끝의 모양에 따라 주입 중에 전자 마이크로 인젝터의 구성을 조정합니다. 참고: 주입 하는 동안 일정한 압력을 적용 하는 것이 좋습니다., 그렇지 않으면 끈적 끈적한 계란 내용 물 유리 바늘에 쉽게 흐를 수 있습니다 그리고 그것을 막을 수 있습니다. 용액은 주입된 액체의 양에 따라 짧은 압력 펄스 또는 일정한 압력으로 주입할 수 있습니다. 바늘 팁이 넓은 개구부를 가지고 있을 때, 너무 많은 용액이 계란에 주입되어 치사(그림 3F-H)를유발합니다. 이 경우 일정한 압력으로 일정한 액체 흐름을 유지한 다음 바늘을 계란에 삽입하여 즉시 꺼냅니다. 너무 많은 오버플로우를 일으키거나 계란이 파열되면 바늘을 바꿉니다.</li>
	<li>주입된 계란의 수에 적합한 크기의 용기에 주입된 계란을 보관하십시오(&20 계란: 작은 접시; >20 계란: 중간 크기의 용기)와 60%-80% RH 및 37°C.</li>
</ol>3화 짝짓기
<ol><li>주입된 계란을 주기적으로 확인하고 곰팡이 성장을 피하기 위해 집게로 손상된 계란을 폐기하십시오(그림 3I, J). 계란에서 너무 많은 곰팡이가 자라면 계란 표면을 70 % EtOH로 청소하십시오.</li>
	<li>부화하기 전에 (계란 누워 후 37 °C에서 약 10 일), 양면 테이프의 표면을 코팅하는 활석 분말에 주입 된 계란과 유리 슬라이드를 찍어. 이것은 부화 된 님프의 스태킹을 피할 수 있습니다. 분말 코팅 유리 슬라이드를 음식, 물 및 접힌 종이가 있는 중간 크기의 용기로 옮겨 곤충을 숨기십시오.</li>
	<li>님프가 부화한 후 유리 슬라이드를 제거합니다. 성인이 될 때까지 주기적으로 식량을 공급합니다. 참고: 개인이 부화 한 후 성인기에 도달하는 데 약 2.0-2.5 개월이 걸립니다(그림 1A). 성인 단계는 여성의 잘 발달 된 난란에 기초하여 판단된다(그림 1B).</li>
	<li>개인을 짝짓기 위해 실험실 식민지에서 중간 크기의 용기로 필요한 야생형 여성 성인을 옮기고 37°C에서 적어도 14일 동안 배양하여 처녀인지 확인합니다. 참고 : 성인 T. 국내가 "생식 및 용해 주기"라고 불리는 몰링과 짝짓기의 반복 주기를 가지고 있기 때문에 실험실 식민지에서 처녀 여성을 수집 할 필요가 없습니다, 여성은 각 몰트와 정자를 버리고 다음 수정 주기13에서다시 짝짓기.</li>
	<li>주입된 달걀과 야생형 성인에서 개발한 남성 또는 여성 G0 성인을 식품, 접힌 종이, 작은 면 조각으로 작은 플라스틱 접시(Ø 100mm x 40mm)로 옮기십시오(그림2C'및 짝짓기 접시). 짝짓기 접시를 60%-80% RH(그림2C)로더 큰 용기에 보관하십시오. 참고: 여러 야생형 성인이 요리에 포함되어 성공적인 짝짓기의 기회를 높일 수 있지만 높은 성공률은 일대일 페어링으로 달성되었습니다.</li>
</ol>4. 게노티핑
<ol><li>각 gRNA에 대한 PCR 프라이머 쌍을 설계하여 gRNA를 대상으로 하는 사이트를 포함하는 100-200 bp 제품을 증폭시합니다. 각 프라이머 서열을 게놈 어셈블리에 대하여 폭발하여 그 특이성을 검사한다(도 4A에서 백색 유전자의 표적화를 위한 예가 도시됨).</li>
	<li>G0 성인의 생식선 변형을 확인하십시오.<ol>
<li>계란이 놓인 지 5일 후, 각 G0 성인 쌍에서 개별 G1 알을 0.2 mL 튜브(튜브 당 1개의 달걀; 장기 보관시 -20°C에서 수집한 샘플을 저장)로 수집합니다. 면층을 분리하여 계란을 수집합니다. 참고: 각 짝짓기 쌍에서 최소 12G1 님프를 유전자형으로 사용하여 생식선 변속기의 성공을 평가하는 것이 좋습니다(대표 결과참조).</li>
		<li>각 튜브에 0.25 mg/mL Proteinase K 용액(Tris-EDTA 버퍼에 용해)의 15μL을 추가하고, 이쑤시개로 시료를 잠시 균질화하고, 55°C에서 3~16h의 배양한다.</li>
		<li>10 분 동안 95 °C에서 샘플을 배치하여 Proteinase K를 비활성화합니다.</li>
		<li>각 튜브에 증류수 90μL을 넣고 잘 섞습니다. 4.1 단계에서 설계된 프라이머를 포함하는 10 μL PCR 반응 믹스에서 2 μL의 상체체를 사용하십시오. 참고: 원유 템플릿에 최적화된 DNA 폴리머라제의 사용은 충분한 PCR 증폭에 도달하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>PCR 제품을 분석하기 위해 마이크로칩 전기포고시스템(도3B;참조 Ohde et al., 2018)을 사용하여 이테로두플렉스이동성 분석(HMA)을 수행한다. 참고: 돌연변이는 두 가지 대체 방법으로 평가될 수 있습니다: (1) 표준 젤 폴리머를 가진 HMA, 예8% 폴리아크릴라미드14; (2) T7 엔도누리스를 함유한 PCR 제품의 소화, 아가로즈 젤전기포고증(15)이뒤따랐다.</li>
		<li>G0 성인의 생식선에 돌연변이가 함유되어 있고 다른 것을 폐기하여 G1 님프만 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>G1 님프/어른의 개별 지피<ol>
<li>G1 님프를 흡구대 또는 페인트 브러시로 24웰 플레이트로 분리합니다. 상기와 같이 상급과 함께 24웰 플레이트를 더 큰 용기(예를 들어, 본 프로토콜에 사용되는 중형 컨테이너)에 놓아 RH를 60%-80%(도1D)를유지한다. 인공 일반 생선 식품의 공급을 유지(그림 1D'). 참고 : 이 단계는 님프칼과 성인 단계의 모든 지점에서 수행 할 수 있지만, 그것은 성인기에 도달 한 직후 페어링 하기 직전에 그것을 수행하는 것이 좋습니다 (>2.5 주사 후 개월; 그림 1B) 큰 용기에 불꽃을 유지하는 것이 더 쉽기 때문입니다. 개별 양육은 다음 단계에서 각 G1 님프의 유전자형을 추적하기 위해 필요합니다. 동일한 G0 성인의 G1 님프는 다른 돌연변이를 가질 수 있습니다.</li>
		<li>집게를 사용하여 님프/성인으로부터 자궁과 소달 필라멘트를 꼬집고 당기고 50 μL EtOH가 들어있는 0.2 mL 튜브로 수집합니다(수집된 샘플을 장기 보관시 -20°C에 저장). 참고: 정전기로 인해 이 작은 샘플의 손실을 방지하기 때문에 조직 샘플은 EtOH에서 수집됩니다. 곤충의 움직임을 중지해야하는 경우, 조직 샘플을 복용 할 때 얼음에 님프 / 성인을 마취. T. 국산은 얼음에 장기 냉각 후 살아남을 수 없기 때문에, 1 분 이상 마취하고 즉시 실온으로 다시 이동하지 마십시오. 자궁과 소달 필라멘트의 절제는 사망률의 증가를 유발하지 않습니다.</li>
		<li>EtOH를 증발시키기 위해 70°C에서 15분 동안 열 블록에 뚜껑이 열리는 샘플 튜브를 놓습니다.</li>
		<li>지노티핑을 위해 4.2.2-4.2.5 단계를 반복합니다.</li>
		<li>돌연변이 밴드 패턴이 표준 Sanger 시퀀싱 서비스에 관찰되는 PCR 제품을 제출합니다.</li>
		<li>원하는 돌연변이를 가진 G1 님프/성인을 유지하고 다른 돌연변이를 폐기하십시오(대표 시퀀싱 결과에 대한 그림 4C 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>짝짓기 접시에 원하는 돌연변이를 포함하는 성인을 교차하고 동형 가우성 돌연변이 균주를 확립하기 위해 다음 세대를 얻을.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. 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저자는 공개 할 것이 없습니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 원하는 T. 국산 돌연변이의 성공적인 생성을 위해, 주사를 위해 충분한 수의 단계적 배아를 수집하는 것이 우선이다. T. 국산 계란의 충분한 수의 일정한 컬렉션의 경우, 핵심은 모든 성인 몰트(13)후에 반복되는 일련의 복잡한 짝짓기 동작의 성공적인 완료에 도움이 될 것이기 때문에 낮은 인구 밀도를 가지도록 용기의 적절한 크기를 선택하는 ?...

Thermobia 국내는 가장 기저 곤충 주문 중 하나에 속한다, Zygentoma, 이는 조상 과 날개없는 수명 주기를 유지. 이러한 기저 계통유전학적 위치와 조상특성은 이 종을 지구상의 곤충의 성공기막이되는 메커니즘을 연구하기 위한 매력적인 모델로 설정하여 기술된 동물종1의70% 이상을 커버한다. T. 국내는 상대적으로 짧은 수명 주기 (태아에서 생식 성인에 2.5-3.0 개월)와 같은 실험실 모델로적합한 기능 때문에 곤충 생리학의 조상 특성을 연구하기 위해 주로 사용되어 왔습니다. 그림 1A) 그리고 쉽게 번식. 지난 3년 동안 신체 계획, 신경 분화 및 circadian 리듬2,3,4와같은 다양한 특성의 조상 특성을 조사하기 위해 그 사용이 확장되었습니다.
T. 국내에서 고급 유전 도구의 응용 프로그램은 더 넓은 연구 분야에서 이러한 기여를 가속화 할 수 있습니다. 성공적인 RNA 간섭(RNAi)-매개 유전자 녹다운 배아, 님프, 및 성인은 T. 국도4,5,6에서보고되었다. 전신 RNAi의 효율은 여전히 매우 종 의존성-예를 들어, 그것은 일반적으로 epidoptera 순서7에서낮은 반면 콜옵테라에서 높다. T. 국내에서 RNAi 노크다운의 효율성과 기간은 아직 평가되지 않았습니다. RNAi 이외에, 우리는 이전에 T.국내8에서성공적인 CRISPR / Cas9 중재 유전자 녹아웃을보고했다. CRISPR/Cas 시스템은 특히 표적 유전자 녹아웃을 위해 곤충의 게놈 편집을 위해 널리 적용되었습니다. 그 사용은 CRISPR/Cas 시스템의 성분을 핵9로전달하기 위한 프로토콜의 확립 후 외인성 구조를 노크함으로써 유전자 리포터 분석, 세포 계보 추적 및 전사 활동의 조작과 같은 다른 응용 분야에 대해 확장될 수 있다. 발표된 게놈어셈블리(10)와 결합하여, T. 국내에서 CRISPR/Cas 기반 게놈 편집의 폭넓은 사용 및 추가 개발은 곤충의 뛰어난 적응적 성공 뒤에 있는 진화 메커니즘에 초점을 맞춘 연구를 용이하게 할 것이다. 여기서, 우리는 CRISPR/Cas9를 사용하여 돌연변이 균주를 생성하기 위하여 배아 미세 주입및 짝짓기 성인 T. 국내를 위한 상세한 프로토콜을 기술합니다. 이 새로운 방법을 고려하여, 우리는 이러한 기술의 성공적인 응용 프로그램에 대한 비 전통적인 모델 종의 독특한 생물학을 고려하는 중요성에 대해 논의.

<table><tbody><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>83-3738</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &amp;micro;g</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-static cleaner</td><td>Hozan</td><td>Z-292</td><td>for removing static electricity from a 24-well plate</td></tr><tr><td>Barrier Box 20.7L</td><td>AS ONE</td><td>4-5606-01</td><td>Large container</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>Electronic microinjector</td></tr><tr><td>Femtotip II, injection capillary</td><td>Eppendorf</td><td>5242957000</td><td>Glass injection capillary</td></tr><tr><td>High Pack 2440mL</td><td>AS ONE</td><td>5-068-25</td><td>Middle-sized container</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Panasonic</td><td>MIR-554-PJ</td><td>for 37 &amp;deg;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td></tr><tr><td>KOD Fx Neo</td><td>Toyobo</td><td>KFX-101</td><td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td>for holding the micromanipulator</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>Shimadzu</td><td>MCE-202</td><td>Microchip electrophoresis system</td></tr><tr><td>NiceTac</td><td>Nichiban</td><td>NW-5</td><td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td></tr><tr><td>Paint brush (horse hair)</td><td>Pentel</td><td>ZBS1-0</td><td></td></tr><tr><td>Plant culture dish</td><td>SPL Life Sciences</td><td>310100</td><td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>SZX 12 microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX 12</td><td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td></tr><tr><td>Talcum powder</td><td>Maruishi</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Goldfish Gold Growth</td><td>Spectrum Brands</td><td></td><td>Artificial regular fish food</td></tr></tbody></table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

파이어 브라트 Thermobia 국내는 지구상에서 성공적인 진화 방사선을 주도 곤충의 발달 메커니즘을 연구에 적합한 병형, 날개없는 종입니다. 게놈 편집과 같은 유전 공구의 응용은 Evo-Devo 접근에 있는 진화적인 전환에 책임 있는 유전 변경을 이해하는 열쇠입니다. 이 문서에서는 T. 국산균의 돌연변이 균주를 생성하고 유지하기 위한 현재 프로토콜을 설명합니다. 우리는 우리가 주입된 태아에서 안정적으로 높은 생존율을 얻을 수 있도록 보고된 습식 주입 방법에 대한 대안으로, 건식 주입 방법을 보고합니다. 또한 성인을 짝짓기하고 고효율로 후속 세대를 얻기 위해 최적화된 환경 설정을 보고합니다. 우리의 방법은 비 전통적인 모형 유기체에 게놈 편집 방법의 성공적인 적용을 고려하여 각 종의 독특한 생물학을 취하는 의 중요성을 강조합니다. 우리는 이러한 게놈 편집 프로토콜이 실험실 모델로 T. 국내를 구현하고이 종에서 유용한 유전 도구의 개발 및 적용을 더욱 가속화하는 데 도움이 될 것으로 예측합니다.

우리 손에는, 약 100개의 계란이 적당한 팁(도 3C)이있을 때 단 하나 주입 모세관으로 잘 주입될 수 있습니다. gRNA/Cas9 리보뉴클레오단백질 복합체를 주사하여 계란 을 낳은 후 첫 8시간 내에 배아에 있는 gRNA 표적 부위에 인델이 생성된다. 이것은 주입된 생성 (G0)의 몇몇 세포에 있는 쌍경변 돌연변이를 일으키는 원인이 되고 이렇게 돌연변이 모자이크 표현형은 일반적으로 G0에...

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Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

우리는 사육, 계란의 미세 주입 및 게놈 편집 후 돌연변이 균주를 생성하고 유지하기 위해 파이어 브라트 Thermobia 국산의 효율적인 짝짓기를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

파이어 브라트 Thermobia 국내에서 게놈 편집을위한 계란 미세 주입 및 효율적인 짝짓기

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

egg-microinjection-efficient-mating-for-genome-editing-firebrat

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

4.3K 조회수.  Kyoto University. 우리는 사육, 계란의 미세 주입 및 게놈 편집 후 돌연변이 균주를 생성하고 유지하기 위해 파이어 브라트 Thermobia 국산의 효율적인 짝짓기를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,<em&gt; Ceratitis의 capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

연구

유전학

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

그릴루스 바이마쿨라투스 계란 주입

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

발생학

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

행동분석학

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Microinjection 웨스턴 옥수수 Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, 배아의 생식 변환, 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집과

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

생체공학

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

CRISPR/Cas9 게놈 편집을 위한 옥수수 Planthopper, Peregrinus maidis, 배아의 미세주입

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

나소니아 vitripennis에서 RNAi와 CRISPR 유전자 편집을위한 푸팔과 성인 주사

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

생물학

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic pest management strategies. The most used transposable element in insect transformation is piggyBac, and piggyBac-based germline transformation has been successfully conducted in model insects. However, it is still challenging to employ this technology in non-model insects that include agricultural pests. This paper reports on germline transformation of a global agricultural pest, the fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, using the hyperactive piggyBac transposase (hyPBase).
In this work, the hyPBase mRNA was produced and used in place of helper plasmid in embryo microinjections. This change led to the successful generation of transgenic FAW. Furthermore, the methods of screening transgenic animals, PCR-based rapid detection of transgene insertion, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)-based determination of the integration site, are also described. Thus, this paper presents a protocol to produce transgenic FAW, which will facilitate piggyBac-based transgenesis in FAW and other lepidopteran insects.

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Successful germline transformation in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, was achieved using mRNA of hyperactive piggyBac transposase.

가을 육군벌레, 스포드옵테라 검소한에서 활동적인 피기박 트랜스포사스 중재 된 세균라인 변환

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...