이 프로토콜은 사람들이 다른 유체 전단 응력 하에서 내피 세포 형태와 영역에서 분자의 발현을 분석하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 주요 장점은 상이한 유체 전단 응력 하에서 혈관 내피 세포의 직접적인 평가를 제공한다는 것입니다. 이 절차를 수행 할 때, 주요 단계는 갓 준비 파라 포름 알데히드를 사용하고 좋은 관류를 수행하는 것입니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 12주 된 C57BL/6 마우스의 마취로 이 절차를 시작합니다. 꼬리를 부드럽게 꼬집어 적절한 마취를 확인합니다. 마우스의 발을 접착제 테이프로 종이 타월 더미에 테이프로 테이프로 놓습니다.
마우스의 피부를 집게로 잡고 복부에서 흉부 꼭대기까지 가위로 피부를 자른다. 날카로운 가위로 흉곽 아래복을 엽니다. 흉골을 집게로 들어 올리고 다이어프램을 자른다.
그런 다음 흉곽을 잘라 흉부 구멍을 노출합니다. 가위로 간 바로 위에 있는 베나 카바를 잘라냅니다. 압력은 5 분 동안 동맥 나무를 pererle, 폐와 간 창백해질 때까지, 왼쪽 심실을 통해, 밀리리터 헤파린 당 40 단위를 포함하는 미리 차가운 정상 식염수와.
그런 다음 PBS에서 4 분 동안 미리 냉각 된 4 % 파라 포름 알데히드와 함께 퍼퓨즈하십시오. 대자가 노출 될 때까지 모든 근육, 장기 및 지방을 제거하십시오. 해부 현미경 아래에 마우스를 놓습니다.
섬세한 집게와 섬세한 가위를 사용하여 해부 현미경으로 대어타를 명확하게 노출시키고 대어타를 따라 결합 조직을 가능한 한 깨끗하게 제거하십시오. 심혼에서 체강 트렁크에 섬세한 가위를 매치하여 흉부 대어를 해부합니다. 대마를 PBS와 함께 6센티미터 세포 배양 접시에 넣습니다.
대동맥을 세로로 길게 잘라서 먼저 작은 곡선을 따라 잘라낸 다음 마이크로시저를 사용하여 오리지움, 왼쪽 공통 경동맥 및 왼쪽 서브클라비아 동맥을 포함하여 대동맥 아치의 세 가지를 잘라내어 직선 세그먼트가 충족될 때까지 더 큰 곡선을 따라 절단합니다. 10 분 동안 PBS에서 1 % 폴리옥시에틸렌 옥실 페닐 에테르로 대어를 페메아빌화하십시오. 그런 다음 12웰 세포 배양 판에서 실온에서 1시간 동안 2.5%의 폴리소르바테 20을 함유한 트리스 버퍼링 식염수로 10%의 일반 염소 세럼으로 대어타를 차단한다.
다음으로 밀리리터 토끼 안티 VCAM1 당 5 그램을 포함하는 차단 버퍼에서 대어타를 배양하고, 밀리리터 쥐 안티 VE-Cadherin 당 5 그램, 섭씨 4도에서 하룻밤. 세척 용액으로 샘플을 세 번 헹구고, 실온에서 1 시간 동안 형광 컨쥬게이징 이차 항체를 적용하여 어두운 곳에 보관하십시오. 세탁 용액에 세 번 더 헹도 라.
대어테아를 DAPI로 10분 동안 카운터스테인하여 어두운 곳에 보관합니다. 그런 다음 스테인드 대어를 세정용으로 세 번 헹구는 다. 대어타를 곡선 면이 아래쪽으로 덮개 슬립에 놓고, 이전에 커버 슬립에 떨어뜨린 안티페이드 장착 용액으로 천천히 이동합니다.
대마를 부드럽게 펴서 시편을 평평하게 유지합니다. 커버 슬립을 반전시키고 유리 슬라이드에 놓습니다. 시편과 유리 사이의 기포를 피하십시오.
레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 대어타를 검사합니다. 이미지-프로 플러스 소프트웨어를 통해 원한 영역에서 원하는 영역과 다른 채널의 색상 강도를 분석합니다. 마우스 대동맥으로부터 혈관 내피 세포의 종양 염색 이미지가 표시된다.
En face 면역형화 단백질 하나, 내피 마커로서 VE-Cadherin을 통한 발현은 마우스 대동맥의 상이한 영역에서 다양한 유동 패턴으로 도시된다. DAPI는 또한 더 나은 시각화를 위한 세포 핵을 보여주기 위하여 반성되었다. 현미경의 밑에 Z 스택을 통해 볼 때, 내피 및 매끄러운 근육 세포는 그들의 세포 핵 형태에 의해 쉽게 구별될 수 있습니다.
내피 세포 핵은 타원형모양이며, 스핀들 모양의 부드러운 근육 세포 핵보다 더 크다. VCAM-1의 발현은 대오르타 아치의 낮은 곡률, 꾸준한 흐름 아래, 대나타 아치의 더 큰 곡률, 그리고 흉부 대역에서 의 방해된 흐름 아래 영역에서 더 풍부했다. 여기서 마우스 대자의 곡률이 적고 곡률이 적고 곡률과 흉부가 커진다.
올바른 수정을 통해, 이 기술은 또한 내피 세포 내동성 에서 혈관 투과성, 및 거대 분자의 위치의 분석에 적용될 수 있다.
