저자의 연구 활동은 국립 보건원 (National Institute of Health)의 Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551)의 보조금으로 지원됩니다.

안면 면역 염색을위한 마우스 부분 경동맥 결찰 및 마우스 대동맥 및 경동맥의 분리에 대한 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IBT 2014-9231)의 승인을 받았습니다. 1. 좌 경부 동맥 결찰술 <ol><li> 테이블에 12 인치 x 14 인치의 가열 패드를 놓고 외과 공간을 준비하고 패드와 테이블 위에 큰 깨끗한 수술 용 드레이프를 덮으십시오. 실체 현미경의 시야가 가열 패드의 가운데 부분에 오도록 붐 스탠드의 암을 조정하십시오. </li><li> 테이블의 히팅 패드를 켜고 3 단계 조절 다이얼을 중간 열 수준으로 설정합니다. 이 온도 설정에서 수술 보드 표면 (1.6.1 참조)은 38-40 ° C가됩니다. <ol><li> 다른 가열 패드 위에 깨끗한 케이지를 놓습니다. 위와 같이 가열 패드를 켜십시오. 이 케이지는 수술 후 회복 (1.16 참조)과 주거에 사용됩니다. </li></ol></li&gt; <li> 수술 테이블 위에 홍채 가위 (1 쌍), 조직 집게 (1 쌍), 수퍼 그립 집게 (2 쌍), 스프링 가위 (1 쌍), 둔기 견인기 (1 쌍, 2.5mm 폭)가있는 고압 가압 멸균 주머니를 넣고, , 라운드 처리 바늘 홀더 (1), 살균 6-0 실크 봉합사, 면화 팁 응용 프로그램, 미니 면화 팁 애플 리케이션, 수술 커튼, 2 &quot;X 2&quot;거즈 스폰지. 또한 70 % 에탄올이 들어있는 짜내는 병과 수술 용 테이블에 chlorhexidine 외과 용 스크루본을 넣은 병을 넣으십시오. </li><li> 마우스의 무게를 잰다. 체중은 수술 직전에 투여 될 진통제의 적절한 양을 결정하는 데 필요합니다. </li><li> 유도 챔버에 마우스를 놓으십시오. </li><li> 유도 챔버에서 마우스를 마취하기 위해 산소 탱크와 마취 기화기를 켜십시오. 이소 플루 란 수준을 2 %로 유지하십시오. 마우스가 움직이기 전에 3-5 분이 걸린다. <ol><li> 마우스가 마취되고있는 동안입체 현미경 아래에 멸균 수술 용 드레이프 (24 인치 x 24 인치)의 작은 조각을 놓고 수술 표면을 만듭니다. 그런 다음 드레이프 된 표면에 아크릴 외과 용 보드 (70 % 알콜로 세척 됨)를 놓습니다. 따라서 외과 용 보드는 가열 패드 위에 있어야하지만 외과 용 드레이프의 두 층으로 분리되어야합니다. </li></ol></li><li> 마우스가 유도 챔버에서 움직이는 것을 멈 추면 마우스를 수술 전 준비 구역으로 옮기고 기화기 (2 % isoflurane)에 연결된 코 콘에 코를 놓습니다. 전기 트리머 또는 헤어 제거제 로션을 사용하여 자궁 경부 주위의 모발을 제거하십시오. 이 방법으로는 수술 부위에서 완전히 제거하기 어려운 털 조각이 생기지 않으므로 로션을 제거하는 것이 좋습니다. </li><li> 코 콘을 제 위치에 놓고 마우스를 수술 용 보드로 옮깁니다. <ol><li> 오른쪽 및 왼쪽 앞다리를 외과 용 보드에 테이프로 감아 넣으십시오. 양쪽 뒷다리를 아래로 테이프로 감아 서ther 마우스 오른쪽에. 이것은 마우스의 목 부위의 좌측이 수술을 위해보다 양호하게 배치되도록 마우스 몸체의 약간의 회전을 야기한다. </li></ol></li><li> 절개 부위를 70 % 알코올, 클로르헥시딘 외과 수술 용 스크럽 및 다시 70 % 알코올로 소독합니다. 자궁 절개 부위를 제외하고 멸균 된 수술 용 드레이프로 마우스를가립니다. </li><li> 마우스를 완전히 마취하고 intraperitoneal 또는 피하 주사 를 통해 진통 (카로 펜 3-5 mg / kg) 을 주는 발가락 핀치로 확인하십시오. </li><li> 해부 현미경으로, 메스 또는 홍채 가위를 사용하여 자궁 경부 주위에 복부 중간 선 절개를하십시오. 참고 : 입체 현미경의 작동 거리가 제한되어 있기 때문에 가위를 사용하기 때문에 메스를 사용하기가 어렵습니다. </li><li> 왼쪽 총 경동맥 (LCCA)을 옆으로 밀고 혈관을 덮고있는 타액선의 위치를 ​​왼쪽으로 옮깁니다.nimal. </li><li> 수술 분야의 모든 혈관을 확인하십시오 ( 그림 1 ). LCCA는 왼쪽 내 경동맥 (ICA)과 왼쪽 외 경동맥 (ECA)으로 분기됩니다. 표재성 갑상선 동맥 (STA)은 내측의 ECA에서 발생합니다. 후두 동맥 (OA)은 일반적으로 ECA에서 발생하지만 일부 마우스에서는 ICA에서 발생합니다. </li><li> 멸균 된 6-0 실크 봉합사를 사용하여 OA 기기를 제외한 모든 동맥 가지를 라이 게이션하십시오. 이를 위해 다음 두 가지 연결을 만드십시오. <ol><li> 부드럽게 왼쪽 내 경동맥 (ICA) 주위와 아래에 결합 조직을 제거합니다. 포 셉터로 precut 6-0 실크 봉합 (~ 2.5cm)의 조각을 잡고 동맥 아래에 전달하십시오. 다른 한 쌍의 포셉을 사용하여 봉합사를 길이의 1/3 정도로 잡아 당겨 동맥을 결찰하십시오. </li><li> 위에 설명 된 것과 같은 방식으로 왼쪽 외부 경동맥 (ECA) 주위의 결합 조직을 제거하고 왼쪽 상 티로이 근위에 결찰을하십시오d 동맥 (STA) ( 그림 1 ). 수술 분야에서 움직이는 신경 섬유를 손상시키지 않도록주의하십시오. </li></ol></li><li> 이러한 결찰이 이루어지면 타액선을 원래의 위치로 돌려 놓고 멸균 된 생리 식염수 2 ~ 3 방울을 넣어 수술 부위를 수분을 공급하십시오. 6-0 코팅 된 vicryl 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다. </li><li> 수술 후 예열 된 케이지 (1.2.1 참조)에 마우스를 놓습니다. 마우스는 5 분 안에 일어나야하며 주변을 걷기 시작해야합니다. 마우스가 정상적으로 작동하는지 확인한 후 새장을 동물 방에 가져 오십시오. </li><li> 회복 첫 3 일 동안 매일 마우스를 관찰하십시오. 마우스는 실험 프로토콜이 요구하는 다양한 조건 하에서 실험이 요구하는 한 오래 유지 될 수 있습니다. 얼굴 수술 준비는 수술 후 언제든지 가능합니다. </li></ol> 2. 엉덩이 면역 면역 <ol><li> 흡입 과다에 의해 CO 2 로 마우스를 안락사하십시오. </li><li>해부 보드에 누름 (배꼽이 위를 향한) 위치에 마우스를 테이프. </li><li> 홍채 가위를 사용하여 정중선 절개를하여 복강을 노출시킵니다. </li><li> 갈비를 옆으로 흉골로 절단하여 흉강을 노출시킵니다. </li><li> 대정맥에서 딱지를 만들거나 혈액을 배출하기 위해 대퇴 동맥 중 하나를 자릅니다. </li><li> 중력 관류 설정 (120cm 수압)에 첨부 된 26G 바늘을 왼쪽 심실의 꼭대기에 삽입하고 순환계를 헤파린 (40U / mL)이 들어있는 생리 식염수로 관류하십시오. 상처에서 흐르는 식염수가 명확해질 때까지 재관류를 계속하십시오. </li><li> 관류 시스템을 식염수에서 PBS (인산염 완충 식염수)에 4 % 파라 포름 알데히드를 포함하는 고정 솔루션으로 전환하고 5 분 동안 계속해서 관류합니다. </li><li> 무딘 엔드 가위 및 집게를 사용하여 대동맥과 좌우 경동맥을 수확하고 얼음에 정착액이 들어있는 50 ML 원추형 튜브에 넣으십시오. </li><li&gt; 해부 현미경 아래 PBS가 들어있는 페트리 접시에 혈관을 전송하고 조심스럽게 대동맥과 경동맥에 연결된 지방과 결합 조직을 제거합니다. 대동맥과 경동맥을 분리하여 세로로 내피를 노출시킵니다 ( 그림 2 ). </li><li> 우물 당 permeabilizing 솔루션 (PBS에 0.1 % 트리톤 X - 100) 0.5 ML을 포함하는 12 잘 접시의 우물로 별도로 각 그릇을 전송합니다. 실온 (RT)에서 흔들어 10 분간 혈관을 침투. </li><li> PBS로 간단히 씻으십시오. </li><li> 비특이적 항체 결합 부위를 차단하기 위해 TTBS (2.5 % Tween 20를 함유 한 Tris-buffered saline (TBS))에서 30 분 동안 2 차 항체가 만들어진 동물 종에서 혈청을 10 % 정상 배양한다. RT에서 락. </li><li> 4 ° C에서 흔들어 밤새 정상적인 10 % 혈청 (위에서 설명한)으로 TTBS에 적절히 희석 한 기본 항체와 혈관을 품어. 레벨각 항체에 대해 희석 정도를 결정해야합니다. </li><li> 다음의 컨트롤 얼룩을 수행하십시오. <ol><li> 일차 항체 대신에 TTBS로 혈관을 인큐 베이트 한 후 이차 항체와 함께 항온 처리한다. </li><li> 일차 항체가 만들어진 동일한 동물 (종)의 비 면역 (또는 면역 전) 혈청 또는 Ig를 함유하는 TTBS로 혈관을 인큐 베이트 한 다음, 2 차 항체와 함께 항온 처리한다. </li><li> 이차 항체와 함께 배양을 생략하십시오. 이러한 대조 검체는 특정 항체로 염색 할 때 동일한 방식으로 동시에 취급해야합니다. </li></ol></li><li> TTBS로 혈관을 3 번 씻고 10 분간 RT에서 흔들어 준다. </li><li> TTBS에서 10 % 정상 혈청 (위에서 기술 한)으로 적절하게 희석 된 형광 표지 된 2 차 항체와 함께 항온 처리하고 RT에서 흔들어 주면서 1 시간 동안 항온 처리한다. DAPI (4 &#39;, 6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌)로 핵 염색을 동시에 수행 할 수있다.H 2 O에 5mg / mL의 DAPI를 함유하는 DAPI 스톡 용액의 1 / 5,000 부피를 첨가함으로써이 단계를 수행 하였다. </li><li> RT에서 흔들어 10 분 동안 TTBS로 3 번 씻으십시오. </li><li> PBS로 가볍게 헹굽니다. </li><li> 커버 유리 (22mm x 50mm)에 항 - 퇴색 시약 1 방울을 놓고 내피가 아래를 향하게하여 커버 유리에 혈관을 놓습니다. </li><li> 혈관에 슬라이드 유리 (22mm x 75mm)를 놓고 거품을 피하십시오. </li><li> 깨끗한 실험실 닦음 ( 예 : Kimwipe)에 슬라이드를 놓고 두 개의 실험실 닦음으로 슬라이드를 덮으십시오. 슬라이드에 최대 3.5 분 동안 체중 3.5 kg ( 예 : 두꺼운 책에 물 한 병 사용)을 넣고 안면 혈관 표본을 평평하게합니다. </li><li> 무게를 제거하고 coverslip 주위에서 과도한 솔루션을 닦아주십시오. </li><li> coverslip의 네 모서리에 매니큐어를 적용 슬라이드 상자에 슬라이드를 놓으십시오, coverslip면을 위로하고 RT에서 어둠에 보관(또는 4 ° C) 하룻밤. 이 과정은 조직을 더욱 평탄하게 만들고 고배율에서 현미경 검사를 더 쉽게합니다. </li><li> 손톱 광택을 사용하여 coverslip을 완전히 봉인하십시오. </li><li> 매니큐어가 건조하자 마자 현미경 검사를 수행하십시오. </li><li> 필요한 경우 -20 ° C에서 슬라이드를 보관하십시오. </li></ol>

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	<li>Jelev, L., Surchev, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+simple+technique+for+en+face+endothelial+observations+using+water-soluble+media+-'thinned-wall'+preparations.">A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations.</a> J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).</li><li>Neill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+on+venous+endothelium+of+alterations+in+blood+flow+through+the+vessels+in+vein+walls,+and+the+possible+relation+to+thrombosis.">The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis.</a> Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).</li><li>Rogers, K. A., Kalnins, V. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+flow-activated+p90RSK+kinase+accelerates+atherosclerosis+by+inhibiting+SENP2+function.">Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).</li><li>Le, N. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crucial+role+for+p90RSK-mediated+reduction+of+ERK5+transcriptional+activity+in+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> Circ. 127, 486-499 (2013).</li><li>Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+composition+of+stress+fiber-plasma+membrane+attachment+sites+in+endothelial+cells+in+situ.">Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ.</a> Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).</li><li>Nigro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+A+is+an+inflammatory+mediator+that+promotes+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-dependent+mice.">Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice.</a> J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).</li><li>Mattson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+arterial+blood+pressure+in+different+strains+of+mice.">Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice.</a> Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).</li><li>Jinguji, Y., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+fiber+dependent+axial+organization+of+fibronectin+fibrils+in+the+basal+lamina+of+the+chick+and+mesenteric+artery.">Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery.</a> Endothelium. 2, 35-47 (1994).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. 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마우스 혈관을 취급 할 때, 내피가 부서지기 쉽고 과도한 기계적 힘이 내피 세포를 손상 시킨다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 혈관이 수동으로 주사기를 사용하여 관류 될 때 쉽게 발생할 수있는 혈관이 너무 강하게 관류되는 경우 혈관벽에서 내피 세포가 깨지거나 분리됩니다. 일정한 관류 압력을 얻기 위해 우리는 120 cm의 수증기압을 갖는 중력 관류 시스?...

광학 현미경에 의한 조직 병리학 적 연구를 위해, 파라핀 매입 (paraffin embedment) 및 절편 화 및 염색을 위해 생물학적 조직의 3 차원 조각을 통상적으로 처리한다. 파라핀이 묻혀있는 조직 샘플은 3 차원 모두 수 밀리미터가 될 수 있습니다. 그러나, 광학 현미경 검사의 목적을 위해, 빛이 통과 할 수 있도록 먼저 절단되어야하며, 따라서 얇은 부분이 이미징을 위해 충분한 대비를 생성하도록 염색되어야합니다. 절편 된 시편은 일반적으로 두께가 5-10 μm이기 때문에 한 번에 2 차원으로 전체 시편의 매우 작은 부분 만 볼 수 있습니다. 순차적 섹션을 수집하고 각 섹션을 개별적으로 이미징 한 후에 3D 이미지의 컴퓨터를 이용한 재구성을 수행 할 수는 있지만 실제로 지루한 작업입니다. 혈관의 조직 병리학, 특히 죽상 동맥 경화증의 병인 생리를 연구하는 데는 독특한 문제가 있습니다. 죽상 동맥 경화증은 발병하는 집중 질환입니다.혈류가 방해받는 곳에서 국부적으로 또한, 질병은 내막, 큰 동맥의 내피 세포와 세포 외 매트릭스의 단일 층으로 구성된 얇은 조직 내에서 시작됩니다. 이러한 이유 때문에 절개 된 혈관을 사용하여 초기 병변을 찾고 연구하는 것이 쉽지 않기 때문에 병변을 절개하지 못할 수 있습니다. 절에 병이있는 부분이 포함되어 있어도 배지 및 외막에 내피 세포와 기타 혈관벽 세포가 포함 된 5-10 μm 부분 만 보입니다. 전체 마운트 엉 얼굴 (발음 än fäs) 준비는 대동맥 뿌리부터 일반적인 장골 동맥까지 전체 대동맥과 같은 혈관 표면의 넓은 영역을 조사 할 수있게 해줍니다. 특정 항체 및 기타 특정 프로브로 염색 된 그러한 표본을 사용하여, 병변의 위치를 ​​정확하게 지적 할 수 있으며, 또한 다양한 분자 이벤트가 내피 세포에서 발생하는 경우단백질의 발현, 국소화 및 번역 후 변형의 변화와 같은 아테롬 발생 (atherogenesis). atherogenesis를 연구하는 것 외에도 en face preparation에서 관찰 된 내피 세포 모양은 지역 시간 평균 혈류 패턴의 지표로 사용됩니다. 이러한 데이터는 원위치에서 내피 세포의 기계 신호를 연구하는 데 중요합니다. 이러한 목적으로, 일상적인 조직 학적 단면 혈관은 유용하지 않습니다. 따라서 혈관 약과 생물학에있어서 혈관의 표면을 넓게 관찰 할 수있는 혈관 조영 기술을 습득하는 것이 중요합니다. Jelev와 Surchev 1 에 의해 검토 된 바와 같이 혈관 생물 학자들은 혈관의 안면을 관찰하기위한 다양한 방법을 개발했다. 일부 독창적 인 방법은 1940 년대와 1950 년대에 개발되었습니다. 이 방법을 사용하여<html> 혈관의 내부 표면을 줄 지어주는 내피 세포의 기본 구성을 연구 할 수 있습니다. 그러나, 이러한 표면 준비가 준비되는 방법 (Hautchen 방법 2 , 3 , 4 또는 용기 표면 5 의 벗겨짐)과 표본이 염색되는 방식 때문에, 방해받지 않는 형태학을 얻는 것이 항상 가능하지는 않습니다 혈관 벽의 더 깊은 영역으로 혈관 표면의 정보. immunofluorescence 얼룩이 결합 된 전체 마운트 엉 얼굴 선박 준비는 우리뿐만 아니라 혈관 벽의 subendotial 지역에 이러한 연구를 확장 이러한 세포의 내피 세포 형태와 단백질 발현 및 지방화를 연구 할 수있었습니다. immunoflucently 스테인드 혈관 얼굴 준비를 사용하여 초기 연구 1980 년 6 월 에 나타나기 시작 ,f &quot;&gt; 7. 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경 검사와 최근 다 광자 현미경 검사의 출현으로 면역 형광 염색 된 안면 혈관 샘플 및 살아있는 동물의 혈관 네트워크에서 혈관 벽 구조의 명확한 초점을 맞출 수 있습니다 이러한 컴퓨터 기반 영상 기법은 인 - 포커스 광학 단면 영상을 생성하고, 이러한 영상을 적층함으로써 조직 내에서 혈관 벽 및 혈관 네트워크의 재구성 된 3D 영상을 얻을 수있다. 또한, 재구성 된 이미지 (12 , 13) 의 Z- 축을 따라 만들어진 섹션의 이미지를 생성 할 수 있습니다. 이 기사에서는 면역 형광 염색을위한 마우스 대동맥과 경동맥의 대면 준비를위한 방법을 설명 할 것입니다. 얼굴 준비이 용기를 실험적으로 조작 한 후에도 만들 수 있습니다. 예를 들어, 경동맥을 부분적으로 결찰 한 다음 수술을 한 후 얼굴을 준비 할 수 있습니다. 이런 이유로 우리는이 기사에서 우리가 경동맥에 부분 연결을 어떻게하는지 설명 할 것입니다. 쥐, 토끼 및 인간과 같은 더 큰 동물에게서 유사한 준비를 만들기와 비교해, 쥐 배는 크기가 작아서 더 부서지기 쉽고, 따라서 혈관의 외과 단절 동안 핸들링과 항체 염색법과 현미경 검사를 위해 그들을 준비 할 필요가있다. 유전자 변형을 위해 가장 일반적으로 사용되는 동물 모델은 마우스이기 때문에 많은 연구자가 마우스 혈관을 손상시키지 않으면 서이를 처리하는 것이 중요합니다. 이 원고에서는 마우스 대동맥과 경동맥의 얼굴을 만들 때 마우스 혈관을 다루는 방법을 설명 할 것입니다. 데모 목적으로 야생형 C57 / b6 마우스를 사용합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9788429</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12556005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 coated vicryl suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J833G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF488 goat anti-rat IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF546 goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD144 (Ve-Cad)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555289</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG</td>
			<td>Santa Cruze Biotechnology</td>
			<td>Sc-8304</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aoto Flow System</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>EZ-AF9000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave Wrap. 24x24in</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>4024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt retractors, 2.5mm wide</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18200-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caprofen (Rimadyl)&#160;</td>
			<td>zoetis</td>
			<td>NADA#141-199</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine Scrub, 2%</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXCHLOR2-PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges 2x2</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>KC2146</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating pad, 12X14</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0667724</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x50mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>GS05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution 4% in PBS</td>
			<td>Santa Cruze Biotechnology</td>
			<td>SC-281692</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes 100x15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade mountant with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P-36935</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan cortton swabs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan Mini cotton tipped aplicators</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82004-050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round handled Needle Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12076-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Suture 6/0</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strabismus Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14075-09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Grip Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00649-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent Dressing</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>TD-26C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327371000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face preparation of mouse blood vessels

파라핀 내장 조직 섹션은 조직 조직학 및 조직 병리학을 연구하는 데 일상적으로 사용됩니다. 그러나, 3 차원 조직 형태가 그런 절에서 무엇인지 결정하는 것은 어렵습니다. 또한 검사 된 조직의 섹션에는 진행중인 연구의 목적에 필요한 조직 내의 영역이 포함되지 않을 수 있습니다. 이러한 후자의 제한은 혈관 병변이 집중된 방식으로 발달하기 때문에 혈관의 조직 병리학 적 연구를 방해한다. 이것은 우리가 혈관 벽의 넓은 영역을 표면에서 더 깊은 영역까지 조사 할 수있게하는 방법을 필요로합니다. 혈관의 전면적 인 준비가이 요구 사항을 충족시킵니다. 이 기사에서는 마우스 대동맥과 경동맥의 안면 조영 및 공 촛점 현미경 및 형광 기반 이미징의 다른 유형을 면역 형광으로 조제하는 방법을 보여줍니다.

endothelium의 전형적인 얼굴 면역 형광 이미지가 그림 3 에 나와 있습니다. 이 이미지는 늑간 동맥 (큰 어두운 달걀 모양의 영역)의 개통 근처에서 찍은 마우스 대동맥의 단일 광학 섹션을 보여줍니다. 대동맥은 항 -VE- 카데 린 (녹색) 및 항 -VCAM-1 (혈관 세포 접착 분자 -1) (적색)으로 이중 염색되었다. 각 내피 세포는 adherens junction에서 녹색 선형 염색?...

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En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

마우스 경동맥 및 대동맥의 얼굴 준비를위한 절차가 설명된다. 특정 항체로 면역 형광으로 염색 될 때 그러한 조제 물은 우리가 공 촛점 현미경으로 전체 혈관 벽 내에서 단백질의 위치 및 세포 유형을 확인하는 것을 가능하게한다.

마우스 혈관의 얼굴 준비

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

20.8K 조회수.  University of Texas MD Anderson Cancer Center.  마우스 경동맥 및 대동맥의 얼굴 준비를위한 절차가 설명된다. 특정 항체로 면역 형광으로 염색 될 때 그러한 조제 물은 우리가 공 촛점 현미경으로 전체 혈관 벽 내에서 단백질의 위치 및 세포 유형을 확인하는 것을 가능하게한다. 

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Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Dissociated 마우스 두피 신경 세포 배양의 준비

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

연구

생물학

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

고립 된 혈액 관류 쥐 폐 준비에 단일 미세 혈관 투과성의 양을

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

마우스 유선의 냉동 섹션에 간접 면역 형광

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

본래 동맥의 내피 층에서 산화 질소와 활성 산소의 욕실 얼굴 인식

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

내생의 면역 형광 분석 및 외인성 센트로 - 동원체 단백질

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

Meiotic 염색체의 준비에서 마우스 Spermatocytes 확산

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

트랜스-내부 세포 배아 줄기 세포의 대량 주입 리드 더 높은 Chimerism 요금

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...