Name: en face preparation of mouse blood vessels
Uploaded: 2017-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
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저자의 연구 활동은 국립 보건원 (National Institute of Health)의 Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551)의 보조금으로 지원됩니다.

안면 면역 염색을위한 마우스 부분 경동맥 결찰 및 마우스 대동맥 및 경동맥의 분리에 대한 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IBT 2014-9231)의 승인을 받았습니다. 1. 좌 경부 동맥 결찰술 <ol><li> 테이블에 12 인치 x 14 인치의 가열 패드를 놓고 외과 공간을 준비하고 패드와 테이블 위에 큰 깨끗한 수술 용 드레이프를 덮으십시오. 실체 현미경의 시야가 가열 패드의 가운데 부분에 오도록 붐 스탠드의 암을 조정하십시오. </li><li> 테이블의 히팅 패드를 켜고 3 단계 조절 다이얼을 중간 열 수준으로 설정합니다. 이 온도 설정에서 수술 보드 표면 (1.6.1 참조)은 38-40 ° C가됩니다. <ol><li> 다른 가열 패드 위에 깨끗한 케이지를 놓습니다. 위와 같이 가열 패드를 켜십시오. 이 케이지는 수술 후 회복 (1.16 참조)과 주거에 사용됩니다. </li></ol></li&gt; <li> 수술 테이블 위에 홍채 가위 (1 쌍), 조직 집게 (1 쌍), 수퍼 그립 집게 (2 쌍), 스프링 가위 (1 쌍), 둔기 견인기 (1 쌍, 2.5mm 폭)가있는 고압 가압 멸균 주머니를 넣고, , 라운드 처리 바늘 홀더 (1), 살균 6-0 실크 봉합사, 면화 팁 응용 프로그램, 미니 면화 팁 애플 리케이션, 수술 커튼, 2 &quot;X 2&quot;거즈 스폰지. 또한 70 % 에탄올이 들어있는 짜내는 병과 수술 용 테이블에 chlorhexidine 외과 용 스크루본을 넣은 병을 넣으십시오. </li><li> 마우스의 무게를 잰다. 체중은 수술 직전에 투여 될 진통제의 적절한 양을 결정하는 데 필요합니다. </li><li> 유도 챔버에 마우스를 놓으십시오. </li><li> 유도 챔버에서 마우스를 마취하기 위해 산소 탱크와 마취 기화기를 켜십시오. 이소 플루 란 수준을 2 %로 유지하십시오. 마우스가 움직이기 전에 3-5 분이 걸린다. <ol><li> 마우스가 마취되고있는 동안입체 현미경 아래에 멸균 수술 용 드레이프 (24 인치 x 24 인치)의 작은 조각을 놓고 수술 표면을 만듭니다. 그런 다음 드레이프 된 표면에 아크릴 외과 용 보드 (70 % 알콜로 세척 됨)를 놓습니다. 따라서 외과 용 보드는 가열 패드 위에 있어야하지만 외과 용 드레이프의 두 층으로 분리되어야합니다. </li></ol></li><li> 마우스가 유도 챔버에서 움직이는 것을 멈 추면 마우스를 수술 전 준비 구역으로 옮기고 기화기 (2 % isoflurane)에 연결된 코 콘에 코를 놓습니다. 전기 트리머 또는 헤어 제거제 로션을 사용하여 자궁 경부 주위의 모발을 제거하십시오. 이 방법으로는 수술 부위에서 완전히 제거하기 어려운 털 조각이 생기지 않으므로 로션을 제거하는 것이 좋습니다. </li><li> 코 콘을 제 위치에 놓고 마우스를 수술 용 보드로 옮깁니다. <ol><li> 오른쪽 및 왼쪽 앞다리를 외과 용 보드에 테이프로 감아 넣으십시오. 양쪽 뒷다리를 아래로 테이프로 감아 서ther 마우스 오른쪽에. 이것은 마우스의 목 부위의 좌측이 수술을 위해보다 양호하게 배치되도록 마우스 몸체의 약간의 회전을 야기한다. </li></ol></li><li> 절개 부위를 70 % 알코올, 클로르헥시딘 외과 수술 용 스크럽 및 다시 70 % 알코올로 소독합니다. 자궁 절개 부위를 제외하고 멸균 된 수술 용 드레이프로 마우스를가립니다. </li><li> 마우스를 완전히 마취하고 intraperitoneal 또는 피하 주사 를 통해 진통 (카로 펜 3-5 mg / kg) 을 주는 발가락 핀치로 확인하십시오. </li><li> 해부 현미경으로, 메스 또는 홍채 가위를 사용하여 자궁 경부 주위에 복부 중간 선 절개를하십시오. 참고 : 입체 현미경의 작동 거리가 제한되어 있기 때문에 가위를 사용하기 때문에 메스를 사용하기가 어렵습니다. </li><li> 왼쪽 총 경동맥 (LCCA)을 옆으로 밀고 혈관을 덮고있는 타액선의 위치를 ​​왼쪽으로 옮깁니다.nimal. </li><li> 수술 분야의 모든 혈관을 확인하십시오 ( 그림 1 ). LCCA는 왼쪽 내 경동맥 (ICA)과 왼쪽 외 경동맥 (ECA)으로 분기됩니다. 표재성 갑상선 동맥 (STA)은 내측의 ECA에서 발생합니다. 후두 동맥 (OA)은 일반적으로 ECA에서 발생하지만 일부 마우스에서는 ICA에서 발생합니다. </li><li> 멸균 된 6-0 실크 봉합사를 사용하여 OA 기기를 제외한 모든 동맥 가지를 라이 게이션하십시오. 이를 위해 다음 두 가지 연결을 만드십시오. <ol><li> 부드럽게 왼쪽 내 경동맥 (ICA) 주위와 아래에 결합 조직을 제거합니다. 포 셉터로 precut 6-0 실크 봉합 (~ 2.5cm)의 조각을 잡고 동맥 아래에 전달하십시오. 다른 한 쌍의 포셉을 사용하여 봉합사를 길이의 1/3 정도로 잡아 당겨 동맥을 결찰하십시오. </li><li> 위에 설명 된 것과 같은 방식으로 왼쪽 외부 경동맥 (ECA) 주위의 결합 조직을 제거하고 왼쪽 상 티로이 근위에 결찰을하십시오d 동맥 (STA) ( 그림 1 ). 수술 분야에서 움직이는 신경 섬유를 손상시키지 않도록주의하십시오. </li></ol></li><li> 이러한 결찰이 이루어지면 타액선을 원래의 위치로 돌려 놓고 멸균 된 생리 식염수 2 ~ 3 방울을 넣어 수술 부위를 수분을 공급하십시오. 6-0 코팅 된 vicryl 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다. </li><li> 수술 후 예열 된 케이지 (1.2.1 참조)에 마우스를 놓습니다. 마우스는 5 분 안에 일어나야하며 주변을 걷기 시작해야합니다. 마우스가 정상적으로 작동하는지 확인한 후 새장을 동물 방에 가져 오십시오. </li><li> 회복 첫 3 일 동안 매일 마우스를 관찰하십시오. 마우스는 실험 프로토콜이 요구하는 다양한 조건 하에서 실험이 요구하는 한 오래 유지 될 수 있습니다. 얼굴 수술 준비는 수술 후 언제든지 가능합니다. </li></ol> 2. 엉덩이 면역 면역 <ol><li> 흡입 과다에 의해 CO 2 로 마우스를 안락사하십시오. </li><li>해부 보드에 누름 (배꼽이 위를 향한) 위치에 마우스를 테이프. </li><li> 홍채 가위를 사용하여 정중선 절개를하여 복강을 노출시킵니다. </li><li> 갈비를 옆으로 흉골로 절단하여 흉강을 노출시킵니다. </li><li> 대정맥에서 딱지를 만들거나 혈액을 배출하기 위해 대퇴 동맥 중 하나를 자릅니다. </li><li> 중력 관류 설정 (120cm 수압)에 첨부 된 26G 바늘을 왼쪽 심실의 꼭대기에 삽입하고 순환계를 헤파린 (40U / mL)이 들어있는 생리 식염수로 관류하십시오. 상처에서 흐르는 식염수가 명확해질 때까지 재관류를 계속하십시오. </li><li> 관류 시스템을 식염수에서 PBS (인산염 완충 식염수)에 4 % 파라 포름 알데히드를 포함하는 고정 솔루션으로 전환하고 5 분 동안 계속해서 관류합니다. </li><li> 무딘 엔드 가위 및 집게를 사용하여 대동맥과 좌우 경동맥을 수확하고 얼음에 정착액이 들어있는 50 ML 원추형 튜브에 넣으십시오. </li><li&gt; 해부 현미경 아래 PBS가 들어있는 페트리 접시에 혈관을 전송하고 조심스럽게 대동맥과 경동맥에 연결된 지방과 결합 조직을 제거합니다. 대동맥과 경동맥을 분리하여 세로로 내피를 노출시킵니다 ( 그림 2 ). </li><li> 우물 당 permeabilizing 솔루션 (PBS에 0.1 % 트리톤 X - 100) 0.5 ML을 포함하는 12 잘 접시의 우물로 별도로 각 그릇을 전송합니다. 실온 (RT)에서 흔들어 10 분간 혈관을 침투. </li><li> PBS로 간단히 씻으십시오. </li><li> 비특이적 항체 결합 부위를 차단하기 위해 TTBS (2.5 % Tween 20를 함유 한 Tris-buffered saline (TBS))에서 30 분 동안 2 차 항체가 만들어진 동물 종에서 혈청을 10 % 정상 배양한다. RT에서 락. </li><li> 4 ° C에서 흔들어 밤새 정상적인 10 % 혈청 (위에서 설명한)으로 TTBS에 적절히 희석 한 기본 항체와 혈관을 품어. 레벨각 항체에 대해 희석 정도를 결정해야합니다. </li><li> 다음의 컨트롤 얼룩을 수행하십시오. <ol><li> 일차 항체 대신에 TTBS로 혈관을 인큐 베이트 한 후 이차 항체와 함께 항온 처리한다. </li><li> 일차 항체가 만들어진 동일한 동물 (종)의 비 면역 (또는 면역 전) 혈청 또는 Ig를 함유하는 TTBS로 혈관을 인큐 베이트 한 다음, 2 차 항체와 함께 항온 처리한다. </li><li> 이차 항체와 함께 배양을 생략하십시오. 이러한 대조 검체는 특정 항체로 염색 할 때 동일한 방식으로 동시에 취급해야합니다. </li></ol></li><li> TTBS로 혈관을 3 번 씻고 10 분간 RT에서 흔들어 준다. </li><li> TTBS에서 10 % 정상 혈청 (위에서 기술 한)으로 적절하게 희석 된 형광 표지 된 2 차 항체와 함께 항온 처리하고 RT에서 흔들어 주면서 1 시간 동안 항온 처리한다. DAPI (4 &#39;, 6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌)로 핵 염색을 동시에 수행 할 수있다.H 2 O에 5mg / mL의 DAPI를 함유하는 DAPI 스톡 용액의 1 / 5,000 부피를 첨가함으로써이 단계를 수행 하였다. </li><li> RT에서 흔들어 10 분 동안 TTBS로 3 번 씻으십시오. </li><li> PBS로 가볍게 헹굽니다. </li><li> 커버 유리 (22mm x 50mm)에 항 - 퇴색 시약 1 방울을 놓고 내피가 아래를 향하게하여 커버 유리에 혈관을 놓습니다. </li><li> 혈관에 슬라이드 유리 (22mm x 75mm)를 놓고 거품을 피하십시오. </li><li> 깨끗한 실험실 닦음 ( 예 : Kimwipe)에 슬라이드를 놓고 두 개의 실험실 닦음으로 슬라이드를 덮으십시오. 슬라이드에 최대 3.5 분 동안 체중 3.5 kg ( 예 : 두꺼운 책에 물 한 병 사용)을 넣고 안면 혈관 표본을 평평하게합니다. </li><li> 무게를 제거하고 coverslip 주위에서 과도한 솔루션을 닦아주십시오. </li><li> coverslip의 네 모서리에 매니큐어를 적용 슬라이드 상자에 슬라이드를 놓으십시오, coverslip면을 위로하고 RT에서 어둠에 보관(또는 4 ° C) 하룻밤. 이 과정은 조직을 더욱 평탄하게 만들고 고배율에서 현미경 검사를 더 쉽게합니다. </li><li> 손톱 광택을 사용하여 coverslip을 완전히 봉인하십시오. </li><li> 매니큐어가 건조하자 마자 현미경 검사를 수행하십시오. </li><li> 필요한 경우 -20 ° C에서 슬라이드를 보관하십시오. </li></ol>

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마우스 혈관을 취급 할 때, 내피가 부서지기 쉽고 과도한 기계적 힘이 내피 세포를 손상 시킨다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 혈관이 수동으로 주사기를 사용하여 관류 될 때 쉽게 발생할 수있는 혈관이 너무 강하게 관류되는 경우 혈관벽에서 내피 세포가 깨지거나 분리됩니다. 일정한 관류 압력을 얻기 위해 우리는 120 cm의 수증기압을 갖는 중력 관류 시스?...

광학 현미경에 의한 조직 병리학 적 연구를 위해, 파라핀 매입 (paraffin embedment) 및 절편 화 및 염색을 위해 생물학적 조직의 3 차원 조각을 통상적으로 처리한다. 파라핀이 묻혀있는 조직 샘플은 3 차원 모두 수 밀리미터가 될 수 있습니다. 그러나, 광학 현미경 검사의 목적을 위해, 빛이 통과 할 수 있도록 먼저 절단되어야하며, 따라서 얇은 부분이 이미징을 위해 충분한 대비를 생성하도록 염색되어야합니다. 절편 된 시편은 일반적으로 두께가 5-10 μm이기 때문에 한 번에 2 차원으로 전체 시편의 매우 작은 부분 만 볼 수 있습니다. 순차적 섹션을 수집하고 각 섹션을 개별적으로 이미징 한 후에 3D 이미지의 컴퓨터를 이용한 재구성을 수행 할 수는 있지만 실제로 지루한 작업입니다. 혈관의 조직 병리학, 특히 죽상 동맥 경화증의 병인 생리를 연구하는 데는 독특한 문제가 있습니다. 죽상 동맥 경화증은 발병하는 집중 질환입니다.혈류가 방해받는 곳에서 국부적으로 또한, 질병은 내막, 큰 동맥의 내피 세포와 세포 외 매트릭스의 단일 층으로 구성된 얇은 조직 내에서 시작됩니다. 이러한 이유 때문에 절개 된 혈관을 사용하여 초기 병변을 찾고 연구하는 것이 쉽지 않기 때문에 병변을 절개하지 못할 수 있습니다. 절에 병이있는 부분이 포함되어 있어도 배지 및 외막에 내피 세포와 기타 혈관벽 세포가 포함 된 5-10 μm 부분 만 보입니다. 전체 마운트 엉 얼굴 (발음 än fäs) 준비는 대동맥 뿌리부터 일반적인 장골 동맥까지 전체 대동맥과 같은 혈관 표면의 넓은 영역을 조사 할 수있게 해줍니다. 특정 항체 및 기타 특정 프로브로 염색 된 그러한 표본을 사용하여, 병변의 위치를 ​​정확하게 지적 할 수 있으며, 또한 다양한 분자 이벤트가 내피 세포에서 발생하는 경우단백질의 발현, 국소화 및 번역 후 변형의 변화와 같은 아테롬 발생 (atherogenesis). atherogenesis를 연구하는 것 외에도 en face preparation에서 관찰 된 내피 세포 모양은 지역 시간 평균 혈류 패턴의 지표로 사용됩니다. 이러한 데이터는 원위치에서 내피 세포의 기계 신호를 연구하는 데 중요합니다. 이러한 목적으로, 일상적인 조직 학적 단면 혈관은 유용하지 않습니다. 따라서 혈관 약과 생물학에있어서 혈관의 표면을 넓게 관찰 할 수있는 혈관 조영 기술을 습득하는 것이 중요합니다. Jelev와 Surchev 1 에 의해 검토 된 바와 같이 혈관 생물 학자들은 혈관의 안면을 관찰하기위한 다양한 방법을 개발했다. 일부 독창적 인 방법은 1940 년대와 1950 년대에 개발되었습니다. 이 방법을 사용하여<html> 혈관의 내부 표면을 줄 지어주는 내피 세포의 기본 구성을 연구 할 수 있습니다. 그러나, 이러한 표면 준비가 준비되는 방법 (Hautchen 방법 2 , 3 , 4 또는 용기 표면 5 의 벗겨짐)과 표본이 염색되는 방식 때문에, 방해받지 않는 형태학을 얻는 것이 항상 가능하지는 않습니다 혈관 벽의 더 깊은 영역으로 혈관 표면의 정보. immunofluorescence 얼룩이 결합 된 전체 마운트 엉 얼굴 선박 준비는 우리뿐만 아니라 혈관 벽의 subendotial 지역에 이러한 연구를 확장 이러한 세포의 내피 세포 형태와 단백질 발현 및 지방화를 연구 할 수있었습니다. immunoflucently 스테인드 혈관 얼굴 준비를 사용하여 초기 연구 1980 년 6 월 에 나타나기 시작 ,f &quot;&gt; 7. 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경 검사와 최근 다 광자 현미경 검사의 출현으로 면역 형광 염색 된 안면 혈관 샘플 및 살아있는 동물의 혈관 네트워크에서 혈관 벽 구조의 명확한 초점을 맞출 수 있습니다 이러한 컴퓨터 기반 영상 기법은 인 - 포커스 광학 단면 영상을 생성하고, 이러한 영상을 적층함으로써 조직 내에서 혈관 벽 및 혈관 네트워크의 재구성 된 3D 영상을 얻을 수있다. 또한, 재구성 된 이미지 (12 , 13) 의 Z- 축을 따라 만들어진 섹션의 이미지를 생성 할 수 있습니다. 이 기사에서는 면역 형광 염색을위한 마우스 대동맥과 경동맥의 대면 준비를위한 방법을 설명 할 것입니다. 얼굴 준비이 용기를 실험적으로 조작 한 후에도 만들 수 있습니다. 예를 들어, 경동맥을 부분적으로 결찰 한 다음 수술을 한 후 얼굴을 준비 할 수 있습니다. 이런 이유로 우리는이 기사에서 우리가 경동맥에 부분 연결을 어떻게하는지 설명 할 것입니다. 쥐, 토끼 및 인간과 같은 더 큰 동물에게서 유사한 준비를 만들기와 비교해, 쥐 배는 크기가 작아서 더 부서지기 쉽고, 따라서 혈관의 외과 단절 동안 핸들링과 항체 염색법과 현미경 검사를 위해 그들을 준비 할 필요가있다. 유전자 변형을 위해 가장 일반적으로 사용되는 동물 모델은 마우스이기 때문에 많은 연구자가 마우스 혈관을 손상시키지 않으면 서이를 처리하는 것이 중요합니다. 이 원고에서는 마우스 대동맥과 경동맥의 얼굴을 만들 때 마우스 혈관을 다루는 방법을 설명 할 것입니다. 데모 목적으로 야생형 C57 / b6 마우스를 사용합니다.

<table><tbody><tr><td>0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500 mL bag</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9788429</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>12556005</td><td></td></tr><tr><td>6-0 coated vicryl suture</td><td>Ethicon</td><td>J833G</td><td></td></tr><tr><td>AF488 goat anti-rat IgG&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11006</td><td></td></tr><tr><td>AF546 goat anti-rabbit IgG&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD144 (Ve-Cad)</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG</td><td>Santa Cruze Biotechnology</td><td>Sc-8304</td><td></td></tr><tr><td>Aoto Flow System</td><td>Braintree Scientific</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Wrap. 24 inch x 24 inch</td><td>Cardinal Health</td><td>4024</td><td></td></tr><tr><td>Blunt retractors, 2.5 mm wide</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-10</td><td></td></tr><tr><td>Caprofen (Rimadyl)&amp;nbsp;</td><td>zoetis</td><td>NADA#141-199</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidine Scrub, 2%</td><td>Med-Vet International</td><td>RXCHLOR2-PC</td><td></td></tr><tr><td>Curity gauze sponges 2 x 2</td><td>Cardinal Health</td><td>KC2146</td><td></td></tr><tr><td>Electric heating pad, 12 x 14</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0667724</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass 22 mm x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393059</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-18</td><td></td></tr><tr><td>normal goat serum</td><td>Equitech-Bio</td><td>GS05</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution 4% in PBS</td><td>Santa Cruze Biotechnology</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade mountant with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P-36935</td><td></td></tr><tr><td>Puritan cortton swabs</td><td>VWR</td><td>10806-005</td><td></td></tr><tr><td>Puritan Mini cotton tipped aplicators</td><td>VWR</td><td>82004-050</td><td></td></tr><tr><td>Round handled Needle Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12076-12</td><td></td></tr><tr><td>Silk Suture 6/0</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5601</td><td></td></tr><tr><td>Strabismus Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14075-09</td><td></td></tr><tr><td>Super Grip Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>00649-11</td><td></td></tr><tr><td>Transparent Dressing</td><td>Cardinal Health</td><td>TD-26C</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC327371000</td><td></td></tr></tbody></table>

en face preparation of mouse blood vessels

파라핀 내장 조직 섹션은 조직 조직학 및 조직 병리학을 연구하는 데 일상적으로 사용됩니다. 그러나, 3 차원 조직 형태가 그런 절에서 무엇인지 결정하는 것은 어렵습니다. 또한 검사 된 조직의 섹션에는 진행중인 연구의 목적에 필요한 조직 내의 영역이 포함되지 않을 수 있습니다. 이러한 후자의 제한은 혈관 병변이 집중된 방식으로 발달하기 때문에 혈관의 조직 병리학 적 연구를 방해한다. 이것은 우리가 혈관 벽의 넓은 영역을 표면에서 더 깊은 영역까지 조사 할 수있게하는 방법을 필요로합니다. 혈관의 전면적 인 준비가이 요구 사항을 충족시킵니다. 이 기사에서는 마우스 대동맥과 경동맥의 안면 조영 및 공 촛점 현미경 및 형광 기반 이미징의 다른 유형을 면역 형광으로 조제하는 방법을 보여줍니다.

endothelium의 전형적인 얼굴 면역 형광 이미지가 그림 3 에 나와 있습니다. 이 이미지는 늑간 동맥 (큰 어두운 달걀 모양의 영역)의 개통 근처에서 찍은 마우스 대동맥의 단일 광학 섹션을 보여줍니다. 대동맥은 항 -VE- 카데 린 (녹색) 및 항 -VCAM-1 (혈관 세포 접착 분자 -1) (적색)으로 이중 염색되었다. 각 내피 세포는 adherens junction에서 녹색 선형 염색?...

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En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

마우스 경동맥 및 대동맥의 얼굴 준비를위한 절차가 설명된다. 특정 항체로 면역 형광으로 염색 될 때 그러한 조제 물은 우리가 공 촛점 현미경으로 전체 혈관 벽 내에서 단백질의 위치 및 세포 유형을 확인하는 것을 가능하게한다.

마우스 혈관의 얼굴 준비

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

20.9K 조회수.  University of Texas MD Anderson Cancer Center.  마우스 경동맥 및 대동맥의 얼굴 준비를위한 절차가 설명된다. 특정 항체로 면역 형광으로 염색 될 때 그러한 조제 물은 우리가 공 촛점 현미경으로 전체 혈관 벽 내에서 단백질의 위치 및 세포 유형을 확인하는 것을 가능하게한다. 

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Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. Its unique anatomy makes the spinotrapezius useful for investigation of ischemic injury and subsequent microvascular remodeling. Here, we demonstrate an arteriolar ligation model in the murine spinotrapezius muscle that was developed by our research team and previously published1-3. For certain vulnerable mouse strains, such as the Balb/c mouse, this ligation surgery reliably creates skeletal muscle ischemia and serves as a platform for investigating therapies that stimulate revascularization. Methods of assessment are also demonstrated, including the use of intravital and confocal microscopy. The spinotrapezius is well suited to such imaging studies due to its accessibility (superficial dorsal anatomy) and relative thinness (60-200 &mu;m). The spinotrapezius muscle can be mounted en face, facilitating imaging of whole-muscle microvascular networks without histological sectioning. We describe the use of intravital microscopy to acquire metrics following a functional vasodilation procedure; specifically, the increase in arterilar diameter as a result of muscle contraction. We also demonstrate the procedures for harvesting and fixing the tissues, a necessary precursor to immunostaining studies and the use of confocal microscopy.

We demonstrate a novel arterial ligation model in murine spinotrapezius muscle, including a step-by-step procedure and description of required instrumentation. We describe the surgery and relevant outcome measurements relating to vascular network remodeling and functional vasodilation using intravital and confocal microscopy.

Microvascular 기능 및 리모델링에 Arteriolar 결합의 영향을 평가하기 위해 손쥐 Spinotrapezius 모델

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. ...

연구

의학

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ability to switch cells from one pathway to another is highly attractive as a therapeutic target. We designed a decoy peptide IRF5D with a molecular modeling software for designing small molecules and peptides.
IRF5D inhibited IRF5, reduced alterations in extracellular matrix, and improved endothelial vasodilation in the tight-skin mouse (Tsk/+). The Kd of IRF5D for recombinant IRF5 is 3.72 &plusmn; 0.74 x 10-6 M as determined by binding experiments using biolayer interferometry experiments. Endothelial cells (EC) proliferation and apoptosis were unchanged using increasing concentrations of IRF5D (0 to 100 &#181;g/mL, 24 h). Tsk/+ mice were treated with IRF5D (1 mg/kg/d subcutaneously, 21 d). IRF5 and ICAM expressions were decreased after IRF5D treatment. Endothelial function was improved as assessed by vasodilation of facialis arteries from Tsk/+ mice treated with IRF5D compared to Tsk/+ mice without IRF5D treatment. As a transcription factor, IRF5 traffics from the cytosol to the nucleus. Translocation was assessed by immunohistochemistry on cardiac myocytes cultured on the different cardiac extracellular matrices. IRF5D treatment of the Tsk/+ mouse resulted in a reduced number of IRF5 positive nuclei in comparison to the animals without IRF5D treatment (50 &#181;g/mL, 24 h). These findings demonstrate the important role that IRF5 plays in inflammation and fibrosis in Tsk/+ mice.

We describe the isolation of cardiac extracellular matrix from C57Bl/6J control mice, tight-skin mice, and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide. We also describe the vasodilation studies on the isolated vessels from C57Bl/6J, tight-skin mice and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide.

격리 혈관 혈관 확장 타이트 피부 마우스의 세포 외 기질의 분리

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

면역학 및 감염병학

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

마우스 뇌 혈관의 정화

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

신경과학

<meta charset="utf8"></head><body>Retinal Pericytes Visualization Using Tissue-Clearing and Fluorescent Labeling

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal vasculature. To provide a detailed view of the morphological characteristics of pericytes, this study described a new approach combining the retro-orbital injection of a fluorescent agent, immunofluorescent-staining, and tissue-clearing treatment. Firstly, the fluorescent tomato lectin was injected into the retro-orbital sinus of the live mouse to label the retinal vasculature. After 5 min, the mouse was sacrificed, and its intact retina was carefully removed from the retinal cup and immunofluorescently stained with platelet-derived growth factor receptor &#946; to reveal the pericytes. Additionally, the stained retina was treated with tissue-clearing reagent and whole mounted on the microscope slide. Through these approaches, the retinal vasculature and pericytes were clearly observed in the transparent retina. Under a confocal microscope, we obtained more opportunities to take high-resolution images for further reconstructing and analyzing the morphological characteristics of pericytes along the retinal vascular tree in a three-dimensional view. Methodologically, this protocol offers an effective approach for visualizing pericytes within the retinal vasculature, providing valuable insights into their role under both physiological and pathological conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Immunostaining을 통한 마우스의 망막 혈관 주위 세포의 3D 시각화

The pericytes in retinal vasculature were examined by immunofluorescent staining with platelet-derived growth factor receptor &#946; after retro-orbital injection of fluorescent tomato lectin. The labeled retina was further treated with the tissue-clearing method and whole mounted for visualizing the three-dimensional views of pericytes surrounding retinal vasculature under a confocal microscope.

Immunostaining을 통한 마우스의 망막 혈관 주위 세포의 3D 시각화 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

생화학

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

마우스 망막 Arterioles Ex Vivo 에서 반응의 측정을 위한 준비 단계

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard therapy, a considerable number of CLI patients are not suited for either surgical or endovascular revascularization. Angiogenic therapies are emerging as an option for these patients but are currently still under investigation. Before application in humans, those therapies must be tested in animal models and its mechanisms must be clearly understood. An animal model of hindlimb ischemia (HLI) has been developed by the ligation and excision of the distal external iliac and femoral arteries and veins in mice. A comprehensive panel of tests was assembled to assess the effects of ischemia and putative angiogenic therapies at functional, histologic and molecular levels. Laser Doppler was used for the flow measurement and functional assessment of perfusion. Tissue response was evaluated by the analysis of capillary density after staining with the anti-CD31 antibody on histological sections of gastrocnemius muscle and by measurement of collateral vessel density after diaphonization. Expression of angiogenic genes was quantified by RT-PCR targeting selected angiogenic factors exclusively in endothelial cells (ECs) after laser capture microdissection from mice gastrocnemius muscles. These methods were sensitive in identifying differences between ischemic and non-ischemic limbs and between treated and non-treated limbs. This protocol provides a reproducible model of CLI and a framework for testing angiogenic therapies.

Here, a critical hindlimb ischemia experimental model is presented followed by a battery of functional, histologic and molecular tests&#160;to assess the effectiveness of angiogenic therapies.&#8203;

힌들보 리 허 혈의 뮤린 모델에서 치료 혈관 신생 평가

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

Dolichoectasia: 혈관성 치매 및 알츠하이머

A Visual Approach for Inducing Dolichoectasia in Mice to Model Large Vessel-Mediated Cerebrovascular Dysfunction

The blood-brain (BBB) is a crucial system that regulates selective brain circulation with the periphery, as an example, allowing necessary nutrients to enter and expel excessive amino acids or toxins from the brain. To model how the BBB can be compromised in diseases like vascular dementia (VaD) or Alzheimer's disease (AD), researchers developed novel methods to model vessel dilatation. A compromised BBB in these disease states can be detrimental and result in the dysregulation of the BBB leading to untoward and pathological consequences impacting brain function. We were able to modify an existing technique that enabled us to inject directly into the Cisterna magna (CM) to induce dilatation of blood vessels using elastase, and disrupt the tight junctions (TJ) of the BBB. With this method, we were able to see various metrics of success over previous techniques, including consistent blood vessel dilatation, reduced mortality or improved recovery, and improving the fill/opacifying agent, a silicone rubber compound, delivery for labeling blood vessels for dilatation analysis. This modified minimally invasive method has had promising results, with a 19%-32% increase in sustained dilatation of large blood vessels in mice from 2 weeks to 3 months post-injection. This improvement contrasts with previous studies, which showed increased dilatation only at the 2 week mark. Additional data suggests sustained expansion even after 9.5 months. This increase was confirmed by comparing the diameter of blood vessels of the elastase and the vehicle-injected group. Overall, this technique is valuable for studying pathological disorders that affect the central nervous system (CNS) using animal models.

저자 스포트라이트: Modeling Vascular Contributions to Alzheimer's Disease in Transgenic Mice (형질전환 마우스에서 알츠하이머병에 대한 혈관 기여도 모델링)

We demonstrate chemically inducing large blood vessel dilatation in mice as a model for investigating cerebrovascular dysfunction, which can be used for vascular dementia and Alzheimer's disease modeling. We also demonstrate visualizing the vasculature by injecting silicone rubber compound and providing clear visual guidance for measuring changes in blood vessel size.

A visual approach for inducing dolichoectasia in mice to model large vessel-mediated cerebrovascular dysfunction(대혈관 매개 뇌혈관 기능 장애를 모델링하기 위해 마우스에서 백우절충증을 유도하기 위한 시각적 접근법)

The blood-brain (BBB) is a crucial system that regulates selective brain circulation with the periphery, as an example, allowing necessary nutrients to ...

마우스 혈관의 얼굴 준비

요약

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Microvascular 기능 및 리모델링에 Arteriolar 결합의 영향을 평가하기 위해 손쥐 Spinotrapezius 모델

격리 혈관 혈관 확장 타이트 피부 마우스의 세포 외 기질의 분리

마우스 뇌 혈관의 정화

Immunostaining을 통한 마우스의 망막 혈관 주위 세포의 3D 시각화

Immunostaining을 통한 마우스의 망막 혈관 주위 세포의 3D 시각화

Immunostaining을 통한 마우스의 망막 혈관 주위 세포의 3D 시각화

마우스 망막 Arterioles Ex Vivo 에서 반응의 측정을 위한 준비 단계

힌들보 리 허 혈의 뮤린 모델에서 치료 혈관 신생 평가

A visual approach for inducing dolichoectasia in mice to model large vessel-mediated cerebrovascular dysfunction(대혈관 매개 뇌혈관 기능 장애를 모델링하기 위해 마우스에서 백우절충증을 유도하기 위한 시각적 접근법)

A visual approach for inducing dolichoectasia in mice to model large vessel-mediated cerebrovascular dysfunction(대혈관 매개 뇌혈관 기능 장애를 모델링하기 위해 마우스에서 백우절충증을 유도하기 위한 시각적 접근법)