본 비디오는 타입 I 콜라겐과 2차원 및 3차원 배양 방법을 사용하여 두 가지 유형의 세포 배양 기판을 준비하는 방법을 보여줍니다. 3차원 배양 방법은 생물학적 환경으로 간주되며, 3차원 배양 기판을 쉽게 제조하는 방법을 보여주는 연구가 유용하다. 수많은 세포 유형에서 동일한 콜라겐을 사용했음에도 불구하고 세포 동작은 2차원 및 3차원 기질 마다 상당히 다릅니다.
3차원 배양기판을 사용하면 살아있는 유기체와 더 유사한 세포 행동을 쉽게 검사할 수 있습니다. 이 방법은 매우 간단하며 최소한의 특수 시약이 필요합니다. 이 방법을 쉽게 시도하고, 3차원 젤이 깨지기 쉽고 제대로 취급하는 것이 매우 중요하기 때문에 시각적 데모는 매우 중요합니다.
시작하려면 적절한 배양 매체를 준비하십시오. 콜라겐 준비를 시작하려면 10x PBS, 탈이온수, 콜라겐, 96웰 컬쳐 플레이트, 빈 2밀리리터 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 파이펫을 사용하여 1.12 밀리리터의 탈온화된 물을 빈 2밀리리터 튜브에 넣습니다.
10x PBS의 마이크로리터 200개를 탈온화물에 넣고 튜브를 여러 번 부드럽게 흔들어 줍니다. 사용하기 직전에 0.66 밀리리터의 콜라겐을 2밀리리터 튜브에 추가하십시오. 튜브를 여러 번 부드럽고 빠르게 흔들어 줍니다.
이 콜라겐 용액 100마이크로리터를 96웰 배양판의 각 웰에 부어 우물의 전체 표면을 덮습니다. 왼쪽에서 오른쪽 동작으로 접시를 부드럽게 흔들어 줍니다. 이산화탄소 인큐베이터에서 1시간 동안 섭씨 37도의 배양판을 배양한다.
그런 다음 접시를 기울여 콜라겐의 겔화를 확인하고 배양판을 깨끗한 벤치로 옮습니다. K110의 마이크로리터 150마이크로리터를 젤에 부드럽게 붓고 우물의 벽을 따라 파이펫을 넣습니다. 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.
그 후 문화판을 깨끗한 벤치로 옮는다. 세포 배양 직전에 파이펫을 사용하여 K110을 부드럽게 폐기하십시오. 먼저 파이펫을 사용하여 1.5 밀리리터 튜브에 1밀리머 염산 1.2 밀리리터에 콜라겐 4 마이크로리터를 추가하고 부드럽게 혼합합니다.
이 콜라겐 혼합물 100마이크로리터를 새로운 96웰 배양판의 각 웰에 붓습니다. 접시를 왼쪽에서 오른쪽으로 부드럽게 흔들고 실온에서 1 시간 동안 배양합니다. 그 후 콜라겐 용액을 폐기하십시오.
파이펫을 사용하여 PBS로 각 것을 잘 씻으시면 됩니다. 배양판의 각 웰에 1%BSA 및 PBS의 150 마이크로리터를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 세포 배양 이전에는 1%BSA 용액을 폐기하십시오.
시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 FEPE1L-8 세포와 K110, 트립신 및 트립신 억제제를 준비한다. 배양 접시에서 배지를 조심스럽게 제거하고 파이펫을 사용하여 0.05 %의 트립신3 밀리리터를 추가하십시오. 접시를 다시 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에서 5분간 배양합니다.
그런 다음 10배율로 위상 조영 현미경을 사용하여 배양 접시 표면에서 세포 분리를 확인합니다. 트립신 억제제의 3 밀리 리터를 추가하고, 15 밀리리터 원심 분리기 튜브에서 분리 된 세포를 수집하는 파이펫을 사용합니다. 원심 분리기는 5 분 동안 200 배 g에서.
그 후, 상체를 버리고, K110의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 놓습니다. 10배율의 상 대비 현미경검사를 사용하여 세포를 계산하고, K110을 사용하여 세포를 밀리리터당 50, 000 세포의 세포 밀도로 희석한다. 부드럽게 우물의 벽을 따라 파이펫하여 배양 판의 각 우물에 셀 서스펜션의 0.1 밀리리터를 시드.
적절한 시간 동안 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하십시오. 먼저 테트라졸륨 소금130마이크로리터와 WST-8을 예열된 K110 1.3밀리리터와 2밀리리터 튜브에 섞는다. 배양판을 깨끗한 벤치로 옮기고 파이펫을 사용하여 우물에서 K110을 부드럽게 버립니다.
K110으로 부드럽게 씻어 내고 참신하지 않은 세포를 씻으십시오. 그런 다음 각각의 우물에 WST-8과 혼합 된 K110의 110 마이크로 리터를 추가합니다. 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.
그 후 문화판을 깨끗한 벤치로 옮는다. 각 우물에서 조건된 배지의 100 마이크로리터를 수집하고 새로운 96웰 배양판의 우물로 옮습니다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 450 나노미터의 흡광도를 측정하고 실행 가능한 셀수를 추정합니다.
세포 형태는 비 섬유종 및 피브릴 형태에서 관찰되며 여기에 표시됩니다. 배양의 처음 2 시간에서, 세포는 콜라겐의 두 형태에 부착하고 퍼짐. 파종 후 3일 후, 비섬유질 형태의 세포가 계속 퍼지고 세포 수가 증가하고, 피브릴 형태의 세포는 제한된 확산을 보여준다.
FEPE1L-8 세포는 I 형 콜라겐의 비 섬유형태와 처리되지 않은 접시 표면에 계속 증식하고 있습니다. 대조적으로, 세포는 피브릴 양식에 증식하지 않습니다. 이 절차를 시도할 때, 3차원 젤이 매우 연약하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
하나는 솔루션 이나 팁 젤과 직접 접촉 하지 않도록 주의 해야 합니다. 이 메서드는 여러 가지 방법으로 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 표본의 멤브레인 성분을 혼합하기 위해 지하 멤브레인을 모방한 세포 배양 기판을 만들 수 있다.
수많은 경우에, 살아있는 바디에 있는 세포외 매트릭스의 기능은 불명합니다. 3차원 배양에 세포를 배양하기 위해, 살아있는 몸과 더 유사한 세포외 매트릭스 성분의 기능을 검사할 수 있다. 3차원 겔 배양 기술을 적용함으로써 세포내 약물의 농도를 효과적으로 테스트할 수 있다.
이 프로토콜은 자신의 목적에 따라 겔화 중에 다른 EGM 구성 요소 또는 성장 인자를 혼합하여 복잡한 3 차원 배양 기판을 개발하는 데 사용될 수 있습니다.
