이 프로토콜은 초기 단계 제브라피시 엠브로이의 극저섹션에 대한 순차적 면역형광 및 면역집중화학에 대한 새로운 절차를 보여 주며, 이는 특정 세포 집단에서 정확한 공동 국소화 분석을 가능하게 한다. 이 프로토콜의 주요 장점은 유연성입니다. 단일 극저온절을 사용하여 면역형과 면역조직화학 기술을 결합하여 조직 형태, 발현의 공동 국소화 및 항체 호환성을 극대화합니다.
이 프로토콜은 이 연구원이 수시로 항체 가용성을 가진 유사한 합병증에 직면하고 수시로 실험의 유사한 모형을 능력을 발휘하기 때문에 그밖 물고기 또는 수륙 양용 모형에 적용될 수 있었습니다. 초기 단계 배아 저온 섹션으로 작업하는 것은 작고 극저온 절개이기 때문에 까다로울 수 있지만, 고급 준비와 연습은이 방법의 모든 투쟁을 완화하는 데 도움이 될 것입니다. 프로토콜에는 특정 처리 및 관리가 필요하며 누군가가 기술을 시연하는 것을 보고도 마스터하기 어려울 수 있는 여러 단계가 있습니다.
시작하려면, 이전 고정 및 혼합물의 모든 전송을 최소화 하는 포셉을 사용 하 여 플라스틱 금형에 15 25 10월 혼합물튜브에서 48 시간 후 수정 키메라 제브라피 배아를 전송. 몰드를 10월 배지로 약 절반 정도 채우고 배아를 부드럽게 섞습니다. 라벨이 부착된 플라스틱 금형을 준비하고 원하는 배아를 빈 라벨이 붙은 플라스틱 금형으로 이송하여 OCT 매체의 이월을 최소화합니다.
그런 다음 10월 배지를 배아로 금형 의 상단에 부드럽게 채웁니다. 시각화를 위한 가벼운 스테레오 현미경으로 작업하면 바늘을 사용하여 원하는 방향으로 배아를 정렬합니다. 그런 다음 준비된 금형을 금속 플랫폼이 있는 절연 용기에 넣고 드라이 아이스에 고정합니다.
얼음 양동이를 금속 플랫폼에 부드럽게 놓고 차가운 챔버를 만들고 약 30 분 동안 얼십시오. 섭씨 영하 20도에서 설정된 저온저스트를 사용하여, 임베디드 배아를 10~12마이크로미터 두께의 저온섹션으로 자르고 현미경에서 주기적으로 섹션의 깊이를 확인하여 위치와 조직을 모니터링합니다. 충전된 유리 슬라이드에 섹션을 놓고 밤새 실온에서 건조시키십시오.
슬라이드를 1X PBS로 5분간 3회 세척하여 적절한 용기에 넣고 세척합니다. 습한 챔버에 평평한 표면에 슬라이드를 놓습니다. 배리어 펜을 사용하여 섹션의 윤곽을 잡아 슬라이드에 액체를 유지합니다.
파이프 200 마이크로리터의 단면당 블록 버퍼및 실온에서 2시간 동안 블록 버퍼로 배양합니다. 1 차적인 항체 희석을 준비하고 버퍼를 막고 파이펫팅하여 잘 섞습니다. 슬라이드를 부드럽게 팁하여 블록 버퍼를 빼내고 습한 챔버로 돌아갑니다.
피펫 200 마이크로리터당 1차 항체 용액의 슬라이드와 200 마이크로리터의 블록 버퍼를 제어로 적절한 섹션으로 한다. 수분을 유지하기 위해 챔버의 가장자리를 밀봉할 수 있도록 분해된 물로 채워진 습한 챔버에서 밤새 섭씨 4도에서 슬라이드를 배양하십시오. 슬라이드를 1X PBS와 적절한 용기에 5분간 세 번 세척합니다.
세척 중에 이차 항체 희석을 준비하고 버퍼를 차단하고 파이펫팅하여 잘 섞습니다. 습한 챔버의 평평한 표면에 슬라이드를 놓은 후 섹션당 200 마이크로리터의 이차 항체 용액을 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 이차 항체 용액의 슬라이드를 30 분 동안 배양하십시오.
슬라이드를 1X PBS로 5분간 3회 세척하여 적절한 용기에 넣고 세척합니다. 슬라이드를 평평한 표면에 놓은 후 핵 염색 용액을 각 섹션에 추가하고 10분 동안 덮은 배양합니다. 핵 염색 용액을 배출한 후 미경형 장착 매체와 유리 커버 슬립으로 슬라이드를 장착합니다.
이미징까지 섭씨 4도에서 어둠 속에서 유지하십시오. 슬라이드를 1X PBS로 개별 용기에 놓고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 평평하게 보관하는 동시에 커버 슬립을 충분히 느슨하게 하여 교반할 때 벗겨집니다. 커버 슬립을 누르거나 커버 슬립을 수동으로 제거하지 말고 최소한의 강제 움직임으로 벗겨질 때까지 기다립니다.
커버 전표를 제거한 후 슬라이드를 신선한 1X PBS로 용기에 부드럽게 전달합니다. 1X PBS를 제거하고 1X 트라이 버퍼식 식염수로 슬라이드를 실내 온도에서 5분 동안 3회 비이온 계면활성제의 0.1%로 배양합니다. 슬라이드를 실온에서 3%의 과산화수소 용액으로 15분 동안 배양합니다.
그런 다음 슬라이드를 평평하게 놓고 블록 버퍼 드롭을 표면에 현명하게 추가합니다. 슬라이드를 부드럽게 팁으로 차단 버퍼를 빼냅니다. 섹션 주변을 건조하고 습한 챔버에 슬라이드를 평평하게 놓습니다.
슬라이드에 섹션당 200 마이크로리터를 추가하고 밤새 섭씨 4도의 습한 챔버에서 배양하십시오. 슬라이드를 부드럽게 팁하여 1차 항체 용액을 빼내고 1X TBST에서 5분간 2회 세척합니다. 그런 다음 배경 차단 시약 드롭을 각 섹션에 현명하게 사용하고 실온에서 습한 챔버에서 20 분 동안 배양 할 준비를하십시오.
슬라이드를 부드럽게 팁으로 차단 버퍼를 빼냅니다. 조심스럽게 섹션 주변을 건조하고 습한 챔버에 평평하게 슬라이드를 배치합니다. 각 섹션에 이차 항체 용액을 사용할 준비가 된 경우 각 섹션에 현명하게 떨어지고 실온에서 습한 챔버에서 30 분 동안 배양하십시오.
슬라이드를 부드럽게 팁하여 이차 항체 용액을 빼내고 1X TBST에서 5분간 2회 세척합니다. 섹션 주변의 부분을 건조한 후 슬라이드를 평평한 표면에 놓고 각 섹션에 HRP 염색체 기판200 마이크로리터를 추가합니다. 기판이 첫 번째 슬라이드에 적용되고 실온에서 3 분 동안 배양할 때 타이머를 시작합니다.
기판 용액을 빼내십시오. 슬라이드를 1X PBS로 적절한 용기에 간략하게 헹구고 부드러운 교반으로 5분 동안 두 번 식수로 씻어내십시오. 헤마톡슬린 염색 용액에 최대 30초 동안 배치하여 슬라이드를 카운터스테인하고, 각 분간 5분간 세 번 세척하여 탈온화된 물에 넣습니다.
스콧의 탭워터가 들어 있는 용기에 슬라이드를 1분간 배양한 다음, 5분간 다시 세 번 다시 씻어 내고, 산화된 물에서 다시 씻어낸다. 화학 후드에 탈이온 물과 자일렌에 희석 된 일련의 에탄올 등급을 통해 슬라이드를 탈수하십시오. 자일렌에서 슬라이드를 제거 한 후 즉시 톨루엔 기반 장착 매체를 추가하고 커버 슬립을 배치합니다.
커버 미끄러짐을 보장하려면 슬라이드의 한쪽에서 다른 쪽으로 천천히 커버 슬립을 낮추어 조직을 가리는 거품을 방지하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 100X 배율로 복합 광 현미경 및 디지털 카메라를 사용하여 슬라이드를 시각화하고 이미지화합니다. 여기서 사용되는 특정 항체는 증식 세포와 기증자 세포를 동시에 검출하기 위해 적극적으로 증식하고 있는 기증자 세포를 확인및 정량화한다.
면역형광과 면역히토화학 을 모두 한 후 개별 세포를 정확하게 식별하기 위해서는 고품질의 이미지를 생성하는 것이 필수적입니다. 이미지 분석 프로그램이 이미지 오버레이를 수행하는 데 사용되었습니다. 이 절차를 시도할 때 면역 히스토케화학 중에 얼룩을 적절히 얼룩지고 반하는 것이 가장 중요합니다.
이 절차 후 추가 방법은 상이한 항체 조합, 조직 유형 또는 종을 사용하는 것과 같은 원래 프로토콜에 대한 수정으로 수행될 수 있다. 또한 관련 데이터를 얻을 수 있는 다양한 방법으로 이미지를 분석할 수도 있습니다. 이 기술은 우리가 세포 상호 작용에 세포를 조사하는 방법으로 공동 지역화 및 다중 유전 배경을 볼 수 있었고 상세한 공동 지역화 분석을 요구하는 그밖 기술과 유사하게 적용될 수 있었습니다.
면역히스토화학에 있는 시약의 대부분은 유해하고 그에 따라 취급되어야 합니다. 후드에서 에탄올, 자일렌 및 장착 뻣뻣함과 함께 작업해야합니다. DAB 폐기물은 유해 폐기물로 폐기되어야 하며 DAB 후 세차류는 표백되어야 합니다.
