전체 마운트 면역 조직 화학은 표지된 항체를 사용하여 조직 또는 유기체에서 직접 단백질의 공간 및 측현관찰을 허용하는 비교적 빠르고 간단한 기술이다. 이 기술의 유용성은 제1단을 단면할 필요 없이 온전한 조직 또는 유기체의 염색을 허용하고 공초점 현미경 검사를 사용하여 단백질 발현 패턴의 3차원 표현을 생성하는 데 사용될 수 있다는 것이다. 면역히스토케는 질병의 근간이 되는 병인학 및 분자 메커니즘을 이해하기 위해 생의학 연구에서 널리 사용됩니다.
그것은 또한 병리학 적인 견본에 있는 종양을 확인하는 귀중한 진단 공구입니다. 먼저 시스템 워터와 메쉬 또는 슬롯 라이너로 채워진 산란 탱크를 준비합니다. 하룻밤 탱크에 그룹으로 성인 제브라 피시 혼합 섹스 쌍을 배치합니다.
14시간/10시간 빛/어두운 주기를 사용하여 9a.m 켜집니다. 다음 주 아침, 불이 켜진 후 산란 탱크 물을 신선한 시스템 물로 바꿔 대변을 제거합니다. 계란이 놓이면 성인을 홈 탱크로 돌려놓습니다.
전송 파이펫을 사용하여 계란을 끌어서 수집합니다. 50개의 달걀을 배아 배지로 반쯤 채워진 각 페트리 요리에 옮긴다. 죽었거나 분열하지 못한 불투명하고 흐린 계란을 제거하십시오.
수정 후 23 시간까지 28.5섭씨에서 계란 의 접시를 배양하십시오. 배아가 수정 후 24시간 이상 더 오래된 경우, 피펫이 배아 배지에서 200 마이크로몰라 PTU로 배아를 전달하여 멜라노발생을 예방한다. 스테레오 현미경으로 초미세 팁 집게를 사용하여 해치지 않은 배아를 비초합니다.
불을 닦은 파스퇴르 파이펫을 사용하여 손상을 최소화하고, 배아 매체에 용해된 1-2%의 아가로즈로 코팅된 유리 또는 플라스틱 페트리 접시로 옮겨넣습니다. 그런 다음 플라스틱 또는 화재 광택 파이펫을 사용하여 배아를 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. 마이크로피펫으로 배아 배지를 제거합니다.
배아를 덮기위해 충분한 액체만 둡니다. 실온에서 부드러운 흔들림으로 1~2시간 동안 4%의 PFA로 배아를 수정합니다. 다음으로, 배아를 1X PBS에서 3회, PBTriton은 5분간 세척합니다.
배아를 즉시 사용하거나 최대 1주일 동안 섭씨 4도에 보관하십시오. 장기 보관을 위해, 탈수하고 영하 20도에서 100% 메탄올에 배아를 저장합니다. 배아를 재수화하려면 최종 세척을 위해 메탄올및 PBS 및 PBTriton의 양이 감소하여 실온에서 각각 5분 씩 직렬 배큐어를 수행하십시오.
원고에 따라 배아 준비를 진행한다. 예를 들어 PBTriton의 10%염소 혈청과 BSA의 밀리리터당 2밀리그램 이내염소 혈청과 일치하는 차단 용액을 선택한다. 배아가 들어 있는 튜브에 블로킹 용액의 0.5 밀리리터를 추가하고 실온에서 1~3시간 동안 로커에 튜브를 놓습니다.
그런 다음 1 차적인 항체에 있는 배아를 흔들면서 섭씨 4도에서 막는 용액및 PBTriton 에 희석된 배양합니다. 아침에는 PBTriton에서 배아를 5회 씩 흔들어 보며 실온에서 각각 10분 동안 세척합니다. 그런 다음 488 나노미터에서 1차 항체 및 원하는 파장의 숙주 종에 기초하여 이차 항체를 선택한다.
배아를 포함하는 관에 차단 용액에 희석된 이차 항체를 추가합니다. 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 흔들면서 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오. 그 후, 알루미늄 호일과 흔들로 덮여있는 동안 실온에서 각각 10 분 동안 PBTriton에서 배아를 세 번 씻으라.
파이펫을 사용하면 배아 배지에서 2%의 아가로즈를 침대 위로 PBS에서 50% 글리세롤 용액으로 배아를 전달합니다. 노른자를 제거하려면 1X PBS의 200 마이크로리터를 우울증 슬라이드 또는 일반 유리 슬라이드로 옮기십시오. 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 하나 이상의 배아를 PBS 액적으로 이동합니다.
초미세 집게와 이중 제로 곤충 핀을 사용하여 노른자를 분해하고 배아의 복부 표면에서 노른자 과립을 매우 부드럽게 긁어냅니다. 노른자 과립을 제거하고 필요에 따라 PBS로 보충하십시오. 장착 후 현미경 단계에 샘플을 놓습니다.
비교적 밝은 예제를 선택하여 관심 영역을 찾습니다. 카메라 노출을 조정하고 게인을 조정하여 신호가 포화 없이 충분히 밝을 수 있도록 합니다. 실험적인 항체 표지배아 사이를 비교할 때 항체 배아를 통제할 때, 동일 노출 설정을 사용합니다.
전체 마운트 면역 히스토케의 이 프로토콜은 제브라피시 발달을 이용한 공간 및 측두단백질 발현연구를 위한 귀중한 도구이다. NMDA 형 글루타민산체의 GluN1 서브유닛은 수정 후 23시간 후 제브라피시 근육을 개발하는 동안 글루타민산 수용체 하위 단위의 발현을 드러냈다. 72시간 후 수정 배아의 냉동 섹션은 슬라이드에 장착되고 확산 되는 세포의 마커인 인-H3를 위해 면역 염색되었습니다.
몇몇 세포는 인-H3를 발현하고 발현은 심실 영역에서 가장 주목할 만했습니다. 마우스 IgG 대조체 항체 및 1차 항체를 제외한 것은 비특이적 발현의 낮은 수준을 드러냈다. 검출을 보장하고 비특이적 얼룩을 최소화하기 위해 1차 항체 호스트 종을 기반으로 적절한 차단 용액과 이차 항체를 선택하는 것이 중요합니다.
면역히스토케는 관찰된 신호가 실제로 관심 있는 단백질인지 확인하기 위해 검증되어야 한다. 후속 실험은 일반적으로 유전자 또는 환경적으로 변형된 유기체를 사용하는 것을 포함합니다. 면역 히스토케는 연구원에게 그 자리에서 단백질을 관찰할 수 있는 능력을 부여하며, 특히 배아 발달 중에 기본 및 적용 생물학 모두에서 수많은 시스템에 대한 이해를 크게 가속화합니다.
메탄올과 포름알데히드는 독성이 있으며 신중하게 처리해야합니다. 폐기물은 제도적 절차에 따라 수거및 폐기해야 합니다.
