이 작품은 NIH 보조금 CA141009 및 GM39067에 의해 지원되었다. 우리는 기록 된 부분에 의견을 E. 파넬 (Parnell)과 R. Yarrington 감사합니다.

1. 마우스 비장 나이브 CD4의 분리는 세포를 T <ol><li> 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC) 프로토콜과 일치하는 인간적인 방식으로 마우스를 희생. 비장을 해부하고 10 % FBS와 DMEM 10 ML을 포함하는 페트리 접시에 넣습니다. </li><li> 비장 세포를 분리하기 위해 두 개의 유리 슬라이드의 서리로 덥은 끝을 사용하여 비장을 분쇄. 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 4시 5 분 200 XG (일반 로터 직경 임상 원심 분리기에 대한 ~ 1,200 RPM)에서 원심 분리하여 세포를 수집 ° C. </li><li> 2 ㎖ ACK 버퍼를 Resuspend 세포는 적혈구, 실온 (RT)에서 1 분을 용해합니다. FBS와 DMEM의 13 ML을 추가하여 반응을 중지합니다. </li><li> 4시 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집 ° C. </li><li> DMEM 포함 FBS 5 ML에있는 세포를 resuspend을하고 70 μm의 메쉬 필터 (BD 팔콘, 고양이 # 352350)를 통해 전달합니다. 세포를 계산하고 진행순진 CD4의 분리에 대한 제조 업체의 지침을 사용하여 CD4 분리 키트 (있는 Miltenyi, 고양이 # 130-095-248)를 사용하여 세포가 T. 4시 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 순진 CD4 T 세포를 수집 ° C. FBS와 DMEM 10 ML에있는 세포를 resuspend을. </li></ol> 2. 염색질의 준비 <ol><li> DMEM에 세포 현탁액을 1 %의 최종 농도 37 % 포름 알데히드를 추가하고 부드럽게하는 가교 DNA 15 분 동안 RT (예 Nutator 사용)에서 록 : 단백질 복합체. </li><li> 125 mm의 최종 농도 1 M 글리신을 추가하여 가교를 중지합니다. RT에서 5 분 바위를 계속합니다. </li><li> 4시 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집 ° C. </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS 포함하는 단백질 분해 효소 억제제 5ml에 현탁하여 세포를 씻으십시오. 3 회 총 얼음처럼 차가운 PBS를 포함하는 단백질 분해 효소 억제제 씻어 4에서 원심 분리하여 세포를 수집 ° C. </li><li> 1 ML에있는 세포를 resuspend을단백 분해 효소 억제제를 포함하는 얼음처럼 차가운 세포 용해 버퍼입니다. 15 분 동안 얼음에 품어. 세포 용해의 효율은 0.4 % 판 블루 용액에 세포의 작은 나누어지는 현탁 (시그마, 고양이 # T8154)와 현미경으로 관찰하여 확인할 수 있습니다. </li><li> 4시 5 분 200 XG (보통 ~ 1,200 RPM)에서 원심 분리하여 핵을 수집 ° C. 조심스럽게 상층 액을 버린다. </li><li> 단백 분해 효소 억제제를 포함하는 핵 용해 버퍼 500 μL의 핵 resuspend을. 15 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 출력 레벨 4, 15 초 버스트, 얼음 4 회 : Misonix의 Sonicator 3,000 프로브 크기 1.6 mm를 사용하여 세포를 초음파 처리. 각 시료는 시료의 과열을 방지하기 위해 다시 sonicating 전에 1-2 분 동안 얼음에 냉각해야합니다. 과열 상호 링크의 반전을 일으킬 수 있습니다. </li><li> 4에서 5 분 16,000 XG (의 microcentrifuge에서 ~ 13,200 RPM)에서 초음파 처리 염색질을 원심 분리기 ° C. </li><li> 분명 supern의 20 μL 나누어지는을atant, DNA 로딩 염료를 추가하고 2 % 아가 로스 젤 (대부분의 응용 프로그램에 대한 초음파 처리 DNA의 이상적인 크기입니다 200-500 BP)를 통해 전기로 초음파 처리 DNA를 확인합니다. </li><li> UV 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 결정합니다. 전단 염색질은 염색질 immunoprecipitation의 반응을 설정하기 위해 즉시 사용 또는 -80 ° C.에 저장할 수 있습니다 일반적으로 우리는 마우스 당 2-3 X 10 6 정화 CD4 T 세포 7.5-10 μg의 DNA를 얻을 수 있습니다. </li></ol> 3. 염색질의 immunoprecipitation (모든 단계 0-4에서 수행해야합니다 ° C) <ol><li> 단백 분해 효소 억제제 칩 희석 버퍼 ㎍ / ㎖ 5-10의 DNA 농도 (총 부피 = 1 ML)에 초음파 처리 염색질을 희석. </li><li> 입력으로 100 μL (10 %)을 저장합니다. 얼음에 저장합니다. </li><li> 나누어지는 450 μl의 이소 타입 제어 (마우스 또는 토끼 IgG의)과 그 항체로 분류 두 개의 1.7 ML의 microfuge의 튜브에 각각. 같은 이소 타입의 여러 항체를 사용하는 경우, 하나의 이소 타입의 contr를OL이 분석을 수행하기에 충분합니다. 다른 동물의 소스 또는 이소 타입의 항체를 사용하는 경우 여러 이소 타입 컨트롤이 필요합니다. </li><li> 2-5 사용되는 항체의 특이성에 따라 특정 항체 μg, 또는 각각의 튜브에 이소 타입 컨트롤을 추가합니다. </li><li> ° C가 염색질 항체 복합체의 형성을 할 수 있도록 4에서 하룻밤 Nutator을 사용하여 튜브를 바위. </li><li> 상기 혼합물에 단백질 G 자석 구슬 (정지 구슬 1:1 슬러리)의 25 μl를 추가하고 4시에 최소한 2 시간 동안 흔들 수 있습니다 ° C. 우리의 공급 업체로부터 구슬을 직접 사용할 수 있습니다. </li><li> 자기 스탠드에의 microfuge 튜브를 놓고 구슬은 자기 측에 수집 할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 구슬을 방해하지 않고 흡인하여 솔루션을 제거합니다. </li><li> 낮은 소금 세척 용액 1 ㎖를 추가하고 부드럽게 Nutator에 5 분 동안 흔들 수 있습니다. 자기 스탠드를 사용하여 비즈를 수집하고 세척 용액을 제거. 한 번 반복합니다.</li><li> 염분 세척 용액 1 ㎖를 추가하고 Nutator에 5 분 동안 흔들 수 있습니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비즈를 수집하고 세척 용액을 제거. 한 번 반복합니다. </li><li> 염화 리튬 세척 용액 1 ㎖를 추가하고 Nutator에 5 분 동안 흔들 수 있습니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비즈를 수집하고 세척 용액을 제거. 한 번 반복합니다. LiCl을의 사용은 구슬 비 특정 크로 마틴 상호 작용의 효과적인 제거를 향상시킵니다. </li><li> TE 용액 1 ㎖를 추가하고 Nutator에 5 분 동안 흔들 수 있습니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비즈를 수집하고 세척 용액을 제거. </li><li> 용출 버퍼 250 μl를 추가하여 구슬에서 DNA를 용출. 실온에서 15 분 동안 바위. 용출액을 피펫하고 새로운 1.7 ML의 microfuge의 관이 물질을 저장합니다. 한 번 더 반복하고 elutions 둘을 결합한다. 구슬을 폐기하십시오. </li><li> 상호 링크가 최종 0.3 M의 농도와 RNase의 1 μL (20m에 5 M NaCl을 추가 역방향<html> 용출 된 DNA에 대한 G / ML). 볼륨을 500 μl를 만드는 단계 3.2에서 저장된 입력에 용출 버퍼 400 μl를 추가합니다. 입력에 0.3 M,의 RNase A, 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 M 트리스 - 염산 산도 6.5의 20 μL와 단백질 분해 효소 K (20 밀리그램 / ML) 1 μL의 10 μL의 1 μL에 NaCl을 추가합니다. </li><li> 건조 가열 블록에 65에서 하룻밤 튜브 ° C를 품어. 샘플, 인감의 증발을 방지하거나 오프닝에서 그들을 유지하기 위해 튜브에 무게를 배치합니다. 하이브 리다이 제이션 오븐도 사용할 수 있습니다. </li><li> RT로 냉각 튜브를 할 수 있습니다. 1 ML 100 % 에탄올을 추가하고 -80에서 2 시간 - 밤새 품어 ° C 침전물 DNA합니다. </li><li> 펠렛에 15 분 DNA 16,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 70 % 에탄올과 공기 건조 펠렛 한 번 DNA 펠렛을 씻으십시오. 멸균 증류수 100 μL의 DNA 펠렛을 resuspend을. </li><li> 용출 버퍼 50 μl의 총 볼륨 QiaQuick 스핀 컬럼 및 용출을 사용하여 DNA를 정화. 이 DNA는 PCR을 위해 사용할 수 있습니다. </li></ol>PCR 반응 (모든 단계는 얼음에서 수행해야 함) &quot;&gt; 4. 준비 <ol><li> 칩 및 해당 입력 샘플에서 모든 DNA 샘플을 수집합니다. 또한, PCR 시약 및 대상 지역의 프라이머뿐만 아니라 제어 영역을 모두 수집합니다. &quot;hotstart&quot;DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소를 사용합니다. 우리는이 절차에서 DNA 증폭을 정량화하기 SYBR 녹색 기반 분석을 사용하지만, qPCR에 mastermix 키트는 필요한 경우 사용할 수 있습니다. </li><li> 의 qPCR 분석 표준 곡선을 생성하기 위해 입력 DNA의 시리얼 희석을 예 : 10 %, 1 %, 0.1 % 및 용출 버퍼의 0.01 % (단계 3.18에서 QiaQuick 스핀 컬럼부터)합니다. 이 표준 곡선 템플릿 집합의 농도 범위와 증가는 칩 농축의 기대 수준에 따라 달라질 수 있습니다, 등 (Genemate, 고양이 # T-3182-1 96 - 웰 플레이트의 각 우물에 입력 DNA 샘플의 10 μl를 분배 ), 중복합니다. </li><li> 각각의 10 ㎖ 칩 이소 타입 컨트롤에서 DNA뿐만 아니라 특정 항체를 분배우물, 세중합니다. </li><li> 대상 프라이머 또는 컨트롤 프라이머 (각 프라이머의 0.1 μM 최종 농도) 중 하나를 포함하는 &quot;마스터 믹스&quot;를 확인하고 각각의 우물에 10 μl를 분배. 예를 들어, 아래 템플릿에 혼합 함유 우물에 대상 뇌관은 녹색으로 표시된 마스터를 분배하고 빨간색으로 표시된 우물에 컨트롤 프라이머 마스터 믹스를 분배. </li><li> 우물의 바닥에 모든 것을 수집하는 RT에서 1 분에 대한 임상 원심 분리기 (~ 1,200 RPM)에서 500 XG에서 광학 플라스틱 바다 표범 어업 필름과 원심 분리기와 PCR 플레이트를 커버. </li><li> PCR 반응을 시작합니다. 우리는이 예제에서 qPCR에를 실행하는 LightCycler 480 II (로슈) 운영하기 LightCycler 480SW 1.5 소프트웨어를 사용합니다. </li></ol> 미리 배양 : 1 사이클 : 95 ° C / 5 분. 증폭 : 40-45주기 : 94 ° C / 5 초, 60 ° C / 5 초, 72 ° C/10 초 (온도가 녹는 그리고 온도보다 2-3 ° C이어야한다 어닐링프라이머 E). 용융 곡선 : 1 사이클. 냉각 : 1 사이클. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> </td><td> 10 % 입력 </td><td> 10 % 입력 </td><td> 이소 타입 </td><td> 특정 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> B </td><td> 1 % 입력 </td><td> 1 % 입력 </td><td> 이소 타입 </td><td> 특정 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> C </td><td> 0.1 % 입력 </td><td> 0.1 % 입력 </td><td> 이소 타입 </td><td> 특정 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 디 </td><td> 0.01 % 입력 </td><td> 0.01 % 입력 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td> 10 % 입력 </td><td> 10 % 입력 </td><td> 이소 타입 </td><td> 특정 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 에프 </td><td> 1 % 입력 </td><td> 1 % 입력 </td><td> 이소 타입 </td><td> 특정 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 지 </td><td> 0.1 % 입력 </td><td> 0.1 % 입력 </td><td> 이소 타입 </td><td> 특정 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td> 0.01 % 입력 </td><td> 0.01 % 입력 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 녹색 : 대상 지역 프라이머를 사용합니다. 빨간색 : 제어 영역 프라이머를 사용합니다. 5. 분석 <ol><li> DNA의 절대 양의 정량화 프로그램의 qPCR 소프트웨어입니다. 중요한 것은, 알 수없는 구체적이고 이소 타입 샘플 보간 DNA 금액에 표준 곡선의 사용 평가와 모든 프라이머의 품질과 효율성의 매칭이 샘플에서 발견 농도의 범위에서 설정 할 수 있습니다. 게다가, 그것은 또한 MOR를 제공합니다전자 usingΔΔCq 및 관련 방법보다 최종 상대 배 농축 결과에 Cq와 (C T 또는 C P) 값을 변환하는 신뢰할 수있는 방법. </li><li> 샘플 편집기로 가서 자신의 표준 곡선 값으로 다양한 희석의 입력 샘플을 (10 %, 1 %, 0.1 % 및 0.01 %)를 포함하는 우물을 표시합니다. 또한 PCR 플레이트가 배치되어 정확히 알 수없는 칩 샘플 우물 레이블을 지정합니다. 다른 qPCR의 기계에 사용되는 해당 소프트웨어에서 각 프라이머 쌍, 표준 곡선 값과 그에 따라 실험 이소 타입 컨트롤 샘플에 대한 반응에 해당하는 하위 집합을 지정합니다. </li><li> LightCycler 소프트웨어에서 집합 편집기에 가서 입력 샘플 우물뿐만 아니라 미지의 칩 샘플을 포함하는 하위 집합을 표시합니다. 미지 시료는 분석을 위해 입력 샘플의 알려진 농도에서 생성 된 표준 곡선을 사용하여 정량화 할 것입니다. 다른 qPCR의 기계에 사용되는 해당 소프트웨어를 지명 한 집합 corresp의각 프라이머 쌍에 대한 모든 반응에 onding. </li><li> PCR 증폭이 완료된 후, &quot;애비 Quant/2nd 파생 최대&quot;로 분석을 수행하고 분석하고 확인을 누르 하위 집합을 선택합니다. 다른 qPCR의 기계에 사용되는 해당 소프트웨어의 각 부분 집합에서 DNA 양에 Cq와 값을 변환합니다. </li><li> 입력 샘플의 알려진 농도를 사용하여 표준 곡선을 생성하고 미지 시료에서 DNA 존재의 절대 양을 표시하는 &quot;계산&quot;을 누릅니다. </li><li> 전단 DNA의 품질이 좋은 경우 프라이머가 대상 영역에 구체적으로 바인딩하는 경우, 그리고 PCR 효율은 가까운 2 있어야합니다. </li><li> 가능한 경우, 동일한 하위 집합 &quot;Tm 값이 호출&quot;을 용해 곡선 분석을 수행합니다. 하나의 피크는 하나의 특정 제품이 증폭되었음을 나타냅니다. 특정 DNA의 증폭은 아가로 오스 겔을 통해 DNA 사다리와 함께 PCR 제품을 electrophoresing하여 테​​스트 할 수 있습니다. </li><li> 로 데이터 내보내기 탭추가 분석을 위해 Microsoft Excel에서 열 수있는 구분 된 텍스트 파일,. </li><li> Microsoft Excel을 사용하여 대상 프라이머의 이소 타입 컨트롤에 특정 항체 DNA 양을 나눕니다. 제어 영역 프라이머에 대해이 단계를 반복합니다. 같은 이소 타입의 여러 항체가 서로 다른 immunoprecipitations 사용하는 경우, 같은 이소 타입 컨트롤에서 값으로 이들 각각을 정상화. 여러 대상 프라이머 쌍을 사용하는 경우 또한, 단일 제어 프라이머 쌍 세트의 DNA 수량은 각 목표 (그림 1 및 2)의 정상화를 위해 사용되어야한다. 출력 값이 아닌 특정 항체 배경 면역 침전을 기준으로 각 위치에서 특정 항체 면역 침전 배 농축을 나타냅니다. </li><li> 에 상대적으로 농축를 얻기 위해 제어 영역 프라이머의 배 농축 (제어 이소 타입하기)를 대상으로 프라이머의 배 농축 (제어 이소 타입 위하여) 분할컨트롤 언 바운드 영역 (그림 1). 중요한 때문에 각 샘플에 대한 총 입력 DNA, 표준 곡선의 생성 위의 immunoprecipitation의 값을 각각의 표준 곡선에서 이미 정상화되어 보간, 다음과 같이 표현주의, 머신 소프트웨어에 의해 총 입력의 비율. </li><li> 면역 침전이나 세정에 사용되는 버퍼의 엄중가 너무 높은 경우, 이소 타입 컨트롤에서 증폭 샘플이 관찰되지 않습니다 immunoprecipitated 동안 특정 항체 immunoprecipitated 샘플에서 강력한 증폭이 관찰 될 가능성이 있습니다. 이러한 시나리오에서는 대상 지역과 언 바운드 영역 모두에 대한 항체 칩에서 이소 타입 제어 칩의 양을 빼는 것이 좋습니다. 상대 농축 언 바운드 영역 (그림 3)에 대한 차이에 의한 대상 지역의 차이를 나누어 계산 될 수있다. </li></ol>

<ol>
	<li>Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chromatin+immunoprecipitation+to+clone+novel+E2F+target+promoters.">Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters.</a> Molecular and Cellular Biology. 21, 6820-6832 (2001).</li><li>Weinmann, A. S., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unknown+target+genes+of+human+transcription+factors+using+chromatin+immunoprecipitation.">Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26, 37-47 (2002).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+nuclear+localization+of+NFAT+in+Foxp3++regulatory+T+cells+independent+of+calcineurin+activity.">Constitutive nuclear localization of NFAT in Foxp3+ regulatory T cells independent of calcineurin activity.</a> J. Immunol. 188, 4268-4277 (2012).</li><li>Shakya, A., Kang, J., Chumley, J., Williams, M. A., Tantin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct1+is+a+switchable,+bipotential+stabilizer+of+repressed+and+inducible+transcriptional+states.">Oct1 is a switchable, bipotential stabilizer of repressed and inducible transcriptional states.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 450-459 (2011).</li><li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(microChIP).">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Lubelsky, Y., Macalpine, H. K., Macalpine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+localization+of+replication+factors.">Genome-wide localization of replication factors.</a> Methods. 57, 187-195 (2012).</li><li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations.">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nature Genetics. 38, 835-841 (2006).</li><li>Sikes, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+method+for+rapid+and+sensitive+chromatin+immunoprecipitation.">A streamlined method for rapid and sensitive chromatin immunoprecipitation.</a> Journal of Immunological Methods. 344, 58-63 (2009).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes.">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li><li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins.">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

프로토콜은 위에 정확하게 칩을 사용하여 기본 림프구의 DNA 농축을 정량화하는 강력한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜의 안정성에 대한 하나의 주요 이유는 생물학적가 복제를 포함합니다. 위의 프로토콜은 세 가지가 독립적으로 계산되는 농축을 복제합니다. 출력은 다음 농축과 변화의 측정을 제공하기 위해 계산 된 표준 편차의 정도를 제공하기 위해 평균한다. 각 샘플은 세 가지 기술은 또?...

<table><tbody><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F-8775</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor tablets</td><td>Roche</td><td>04693116001</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Protein G magnetic beads</td><td>Active Motif</td><td>101945</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>RNase A (20 mg/ml)</td><td>EMD Millipore</td><td>556746</td><td>Store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Proteinase K (20 mg/ml)</td><td>Roche</td><td>03115879001</td><td>Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, pH 8.0</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10966-034</td><td>Store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>SYBR Green I</td><td>Invitrogen</td><td>S7567</td><td>Store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>1 M Glycine</td><td></td><td></td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)</td><td></td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)</td><td></td><td></td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)</td><td></td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)</td><td></td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)</td><td></td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)</td><td></td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td></td><td></td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td></td><td></td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 6.5</td><td></td><td></td><td>Store at RT</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table of Specific Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Clay Adams Brand Nutator</td><td>Becton Dickinson</td><td>Model: 421105</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Masonix Sonicator 3000</td><td>QSonica</td><td>Model: S3000</td><td></td></tr><tr><td>UV Spectrophotometer</td><td>NanoDrop Technologies</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Heating Block</td><td>VWR</td><td>13259-030</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>VWR</td><td>80085-692</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated bench top centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model: Allegra X-12R</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table of Equipment&lt;/strong&gt; </td></tr></tbody></table>

efficient chromatin immunoprecipitation using limiting amounts of biomass

염색질의 immunoprecipitation (칩)은 살아있는 세포의 염색질의 DNA와 다른 단백질의 상호 작용을 결정하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 예를 들면 시퀀스 특정 DNA 결합 전사 인자, 히스톤과 다른 수정 상태와 같은 RNA 중합 효소와 보조 인자와 같은 효소와 DNA 복구 구성 요소를 포함. 그 편재에도 불​​구하고, 소재 모두 벤치 준비 및 상호 작용의 정량적 측정을 허용 정확한 분석을위한 최신 상세한 방법론의 부족이있다. 정보의 부족으로 인해, 또한 어떤 면역 침전과 같은 조건이 실험 조건의 새로운 집합에 대해 다시 최적화해야하기 때문에 칩의 분석은 부정확하거나 잘못 정량 결과에 감염 될 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 궁극적으로 전사 인자에 정액 일에서 파생됩니다 DNA 상호 작용 1,2,하지만 sensiti에 개선의 번호를 통합하기 어려운 얻을 세포 유형에 대한 VITY 및 재현성. 프로토콜이 성공적으로 사용되어왔다 3,4, DNA 농축을 정량화하기 qPCR에 사용하거나, 아래의 프로토콜의 반 정량적 인 변형을 사용하여 두. PCR 증폭 물질이 정량적 분석은 계산 수행 및 분석에 제한 요소를 나타냅니다. 중요한 컨트롤 및 기타 고려 사항에 따라 변경을 표시하지 않는 등 연구중인 단백질 (또는 예상에 구속되지 않도록 예측 intergenic 지역으로 이소 타입을 맞춘 항체의 사용뿐만 아니라 게놈 DNA의 제어 영역의 평가를 포함 실험 조건). 또한, 모든 칩 샘플에 대한 입력 자료의 표준 곡선은 실험 물질에 농축의 절대 수준을 도출하는 데 사용됩니다. 표준 곡선의 사용에 관계없이 설계하는 방법을주의 깊게의 프라이머 세트 사이에 계정의 차이를 고려하고, 또한 효율이 다를 수 있습니다하나의 프라이머 세트에 대한 템플릿 농도의 범위에 걸쳐 ences. 우리 프로토콜은 우리가 광범위 나중에 분석 단계를 포함한다는 점에서 5-8 사용할 수있는 다른 사람과 다른 것입니다.

염색질의 immunoprecipitation (칩) 프로토콜은 따라서 &quot;로드 관리&quot;역할, 게놈의 언 바운드 영역을 증폭 프라이머 쌍의 사용을 통해 PCR에 사용되는 DNA의 양 (있는 경우), 차이 여기에 컨트롤을 선보였다. 그림 3의 예제에서, 우리는 대상 영역으로 마우스 IL2 발기인에 대한 관심과 전사 인자 NFAT 바인딩 사이트의 우리의 단백질 지역 언 바운드로 마우스 Actb 유전자의 코딩 ?...

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Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

우리는 기본 T 세포를 사용하여 염색질의 immunoprecipitation위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 방법에 설립 있지만, 세포의 제한된 수량에 대한 효율성을 개선 조건과 시약의 특정 집합을 사용합니다. 중요한 데이터 분석 단계에 대한 자세한 설명이 표시됩니다.

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.2K 조회수.  University of Utah School of Medicine. 우리는 기본 T 세포를 사용하여 염색질의 immunoprecipitation위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 방법에 설립 있지만, 세포의 제한된 수량에 대한 효율성을 개선 조건과 시약의 특정 집합을 사용합니다. 중요한 데이터 분석 단계에 대한 자세한 설명이 표시됩니다.

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Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Chromatin Immunoprecipitation을 이용한 c-KIT 리간드 프로모터 분석

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

연구

유전학

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a challenge for ChIP due to technical difficulty in isolation of high-quality nuclei with minimal contamination of myofibrils. Previous protocols have attempted to purify nuclei before cross-linking, which incurs the risk of altered DNA-protein interaction during the prolonged nuclei preparation process. In the current protocol, we first cross-linked the skeletal muscle tissue collected from mice, and the tissues were minced and sonicated. Since we found that ultracentrifugation was not able to separate nuclei from myofibrils using cross-linked muscle tissue, we devised a sequential filtration procedure to obtain high-quality nuclei devoid of significant myofibril contamination. We subsequently prepared chromatin by using an ultrasonicator, and ChIP assays with anti-BMAL1 antibody revealed robust circadian binding pattern of BMAL1 to target gene promoters. This filtration protocol constitutes an easily applicable method to isolate high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle tissue, allowing consistent sample processing for circadian and other time-sensitive studies. In combination with next-generation sequencing (NGS), our method can be deployed for various mechanistic and genomic studies focusing on skeletal muscle function.

We present a filtration-based protocol to isolate high-quality nuclei from cross-linked mouse skeletal muscle wherein we removed the need for ultracentrifugation, making it easily applicable. We show that chromatin prepared from the nuclei is suitable for chromatin immunoprecipitation and likely chromatin immunoprecipitation sequencing studies.

Chromatin Immunoprecipitation을위한 Cross-linked Skeletal Musculus로부터 고품질 핵을 준비하기위한 Filtration 기반 방법

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

생화학

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice are physically disrupted by mechanical homogenisation, or a combination of mincing and douncing, in a hypotonic buffer before formaldehyde fixation of the cell lysate. The fixed nuclei are purified by further cycles of mechanical homogenisation or douncing and sequential filtrations to remove cell debris. The purified nuclei can be sonicated immediately or at a later stage after freezing. The chromatin can be efficiently sonicated and is suitable for chromatin immunoprecipitation experiments, as illustrated by the profiles obtained for transcription factors, RNA polymerase II, and covalent histone modifications. The binding events detected using chromatin prepared by this protocol are predominantly those taking place in the muscle fiber nuclei despite the presence of chromatin from other fiber-associated satellite and endothelial cells. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in the adult mouse skeletal muscle.

A novel protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle adapted to the study of gene regulation in muscle fibers by chromatin immunoprecipitation is presented.

마우스 골격 근육에서 Chromatin Immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

생물학

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay: A Technique to Study Protein-DNA Interactions in Cells

Source: Fuchs, A. R.,et al. <a href="https://www.jove.com/t/58270">A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video describes protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, which is a classic technique to demonstrate protein-DNA interactions.This technique is used to identify target genes in human chronic lymphocytic leukemia cells.

염색질 면역침전 분석법: 세포에서 단백질-DNA 상호 작용을 연구하는 기술

Source: Fuchs, A. R.,et al. A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia. J. Vis. Exp. ...