HIV는 세포와 해부학 적 저수지의 지속성으로 인해 불치입니다. 이 방법은 폐에서 분리된 면역 세포의 HIV 저장소 평가를 허용합니다. 이 기술은 폐 점막 T 세포와 HIV의 세포 저장소로 추가 현상 또는 virologic 평가를 위해 BAL 액체에서 폐 점막 T 세포의 격리를 허용합니다.
폐포 대식세포와 CD4 양성 T 세포의 생물학과 HIV 저수지에 대한 그들의 기여를 이해하면 HIV 치료법이 직면한 과제에 대한 중요한 통찰력으로 이어질 수 있습니다. BAL에서 1 차적인 대식세포의 격리는 천식과 결핵과 같은 염증성 또는 전염하는 폐 질환을 포함하여 다양한 다른 연구 영역에 적용될 수 있다. 표준 프로토콜에 따라 인간 환자로부터 BAL 유체를 얻은 후, 생물 안전 캐비닛 내의 50 밀리리터 튜브로 샘플을 전송하기 전에 원래 수집 관에서 유체를 소용돌이시다.
유체가 매우 탁경또는 필라멘트 조직에 의해 오염된 경우, 70 마이크로미터 나일론 메쉬 필터를 통해 새로운 50 밀리리터 튜브로 샘플을 필터링합니다. 원심 분리 후, 새로운 50 밀리리터 튜브로 상체를 전송하고 파이펫 팁을 사용하여 전체 BAL 세포를 포함하는 펠릿을 부드럽게 분해합니다. RPMI 1640 배지의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 10 1.5 밀리리터 미세 센심분리기 튜브 각각의 예약 된 슈퍼 네티미터1 밀리리터를 추가합니다.
남은 상체의 10밀리리터 알리쿼트를 15밀리리터 원내 튜브에 넣고 모든 상류샘플을 영하 80도 저장에 넣습니다. 원래 샘플의 매 25 밀리리터에 대한 매체의 10 밀리리터에 펠릿 세포 현탁액을 희석하고 원심분리에 의해 BAL 세포를 수집합니다. 그런 다음 10%의 태아 소 혈청 또는 FBS로 보충된 중간 크기의 1밀리리터에서 펠릿을 다시 분리하여 계산합니다.
전체 BAL 및 말초 혈액 단핵 세포의 분류를 위해, 스테인드 및 생존성 스테인드 보상 제어를 위해 서브세트 당 두 개의 5 밀리리터 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브 각각에 5 개의 세포에 5 번 10을 추가하고 샘플 당 각 하위 세트 샘플의 나머지 부분을 1 5 밀리리터 튜브에 추가하십시오. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 그들이 사용될 때까지 얼음에 튜브 당 PBS의 100 마이크로 리터에 제어 펠릿을 다시 일시 중지합니다. 어떤 비특이적 결합을 차단하기 위해 섭씨 4도에서 1 시간 동안 Fc 수용체 차단 버퍼의 20 희석중 1 개 중 250 마이크로 리터에서 정렬을위한 세포의 펠릿을 다시 중단합니다.
차단 인큐베이션의 끝에서, 4섭씨에서 추가 1 시간 배양에 대한 관심의 적절한 항체 칵테일을 추가합니다. 1차 항체 배큐어의 끝에서, 원심분리를 위해 각 튜브에 PBS 1밀리리터를 추가하고, 250마이크로리터의 펠릿을 빛으로부터 보호된 얼음에 분류하여 정렬할 때까지 선별한다. 보상 제어를 준비하기 위해, PBS의 1 밀리리터당 각 항마우스 면역글로불린 카파 보상 구슬과 음극 보정 비드 를 마이크로센티슈에 추가하고 비드 솔루션의 100 마이크로리터를 각 샘플에 전송하여 보상에 사용한다.
구슬이 들어 있는 각 별도의 튜브에 각 항체의 마이크로리터 를 추가하고 각 생존성 얼룩 보정 튜브에 1 마이크로리터의 생존성 얼룩을 추가합니다. 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에서 20분 후, 튜브당 PBS 1밀리리터로 샘플을 세척하고 튜브 당 250 마이크로리터의 펠릿을 재보페수합니다. 전체 BAL 셀 스테인드 컨트롤 샘플을 유량 사이토미터에 로드하고 보정 매트릭스를 설정합니다.
다음으로 샘플 튜브를 로드하고 저압하에서 세포를 정렬하고, 노이즈를 배제하고, 라이브 및 CD45 양성 세포를 포함하고, 이중을 배제한다. 더 큰 골수성 인구 내에서 CD206 및 CD169 이중 양성 세포를 폐포 대식세포로 정렬합니다. 더 작은 림프구 집단 내에서 CD3 양성 세포를 분리하고 CD4 및 CD8 단일 양성 모집단을 정렬합니다.
말초 혈액 단핵 세포 샘플을 정렬하려면, 게이트는 노이즈와 이중을 배제하고 입증된 바와 같이 살아있는 CD45 양성 세포를 포함한다. CD3에서 게이팅한 후 단일 양성 단핵구를 정렬하기 위한 CD3-음수, CD14 양성 셀을 게이트하고 CD3 양성, CD4 및 CD8 양성 셀을 게이트하여 단일 양성 모집단을 모두 정렬합니다. 전체 BAL 샘플을 계산할 때, 다른 세포 모형은 더 큰, 둥근 대식세포 및 더 작은, 둥근 림프구를 포함하여 시각화될 수 있습니다.
대식세포는 BAL 유체에서 가장 풍부한 세포 유형으로, 비 흡연자 폐에서 세포의 약 85%를 차지합니다. 이 세포는 거의 독점적인 것처럼 보이는 점에 흡연자에서 풍부하고 비 흡연자에서 관찰 된 대식세포에 비해 약 40 %로 확대되는 경향이있다. BAL 유체 샘플에서 폐포 대식세포를 분류하는 데 사용되는 마커는 식세포 및 시아로데신 수용체 CD169에 존재하는 만노즈 수용체 CD206과 같은 폐포 대식세포의 이전에 설명된 표현형에 기초하여 선택되었다.
그들의 격리에 따라, 폐포 대식세포 및 기타 세포 유형은 초민감성 PCR에 의한 유동 세포측정, 면역 기능 적 분석 또는 저수지 정량화에 의해 면역 페노티핑에 사용될 수 있다. 이 기술은 역사적으로 달성하기 어려웠던 매우 순수한 조직 거주자 대식세포에 대한 액세스를 제공하여 이전에는 상당한 면역 세포 집단을 검사할 수 있습니다.
