이 연구는 미국 육군이나 국방부 분들을 반영하지 않습니다 저자 (들)에 의해 뷰와의 의견 및 보증을 MMM하는 MK와 BC 111,038에 TSA 140,010을 부여 국방부에 의해 지원되고있다.

모든 동물 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)에서 발표 한 &quot;실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드&quot;에 설명 된 지침을 기관 동물 관리 및 텍사스 테크 대학 보건 과학 센터의 사용위원회의 승인을 이어왔다. 상업적으로 사용할 수있는 팔주 십이 세 여성 BALB / c 마우스를 사용합니다. 주사 1 × 10 5 4T1 또는 1 × 유방 지방 패드로 다양한 업체에서 구입할 수 있습니다 GFP를 표현하는 10 5 4T1 세포. 1. 4T1의 문화와 4T1-GFP 세포 및 주사 (14)에 대한 종양 세포 현탁액의 준비 <ol><li> 4T1 및 4T1-GFP 세포 배양 참고 : 달리 명시하지 않는 한 층류 (LAF) 생물 안전 캐비닛에 멸균 솔루션을 사용하여 모든 단계를 수행합니다. <ol><li> RPMI 배지에서 4T1 및 4T1-GFP 세포는 10 % 열 불 활성화 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린를 유지한다G 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 황산염. 주 : 셀의 모든 트립신 처리 및 도금을 계산하여 통로 번호를 확인합니다. 통로의 수는 세포의 발암 및 전이성 전위 영향으로는, 모든 마우스 실험 동일한 통로 번호 세포를 사용하는 것이 중요하다. </li><li> 세포 주입에 앞서 인큐베이터 및 흡 배지에서 80 % 컨 플루 언시에 종양 세포를 함유하는 상기 2 cm T75 플라스크를 제거한다. PBS의 10 ML을 추가하고 나머지 매체를 씻어 부드럽게 플라스크를 회전 한 후 PBS를 대기음. </li><li> 플라스크에 EDTA와 0.25 % 트립신 2 ㎖를 첨가하고, 5 % CO 2로 37 ℃에서 3 분 동안 습한 인큐베이터에서 표면에 균일 용액을 분산 및 배양 기울. </li><li> 세포의 분리를 용이하게하고 신선한 매체의 8 ml에 추가 할 수있는 플라스크를 누릅니다. 최대 피펫 아래로 여러 번 덩어리를 중단하고 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. </li><li> 5 분 동안 원심 분리기 세포. 실온에서 500 XG에.뜨는을 기음과 PBS 10ml에 세포를 씻는다. </li><li> 최대 피펫 아래로 여러 번 덩어리를 중단하고 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. 세포 현탁액 100 ㎕를 취하여 제조자의 지시에 따라 세포 생존력 분석을 이용하여 세포 수를 계산. </li><li> 실험에 사용 된 마우스의 마우스 X 번호 당 10 5 세포 (항상 안전을 위해 여분의 세포를 준비) : 공식을 사용하여 모든 주사에 필요한 세포의 수를 계산합니다. </li><li> 1.1.5에서와 같이 원심 분리기 세포. 신선한 PBS의 양 흡입 재현 탁하고 세포를 통해 상청액을 제거하여 1 × 106 세포 / ml의 최종 세포 농도를 얻기 위해 필요한. 주입을위한 준비가 될 때까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다. </li></ol></li><li> 4T1 또는 4T1-GFP 세포 주입 마우스 절차 <ol><li> 종양 세포 주입 전날, 3 % 이소 플루 란 유도 챔버 마우스 마취. 마우스가 잠 정기적으로 호흡하면, 장소 t그는 코 콘 내부 코 수술 패드 마우스와 이소 플루 란 기화기에 연결합니다. 2.5 %의 이소 플루 란으로 마취를 유지한다. 마우스가 마취되어 있는지 확인하기 위해 마우스 발가락을 꼬집어. </li><li> 주사 부위에 면봉 (오른쪽 가슴 유방 지방 패드)를 사용하여 제모 크림을 적용하고 2 분 동안 기다립니다. 젖은 종이 타월을 사용하여 사이트를 청소, 다시 케이지에 마우스를 놓고는 흉골 드러 누움을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 주사 당일 1.2.2과 쥐를 마취하고 수술 용 패드 위에 놓는다. </li><li> 균일 한 세포 현탁액을 얻기 위해 종양 세포를 함유하는 튜브를 소용돌이. 대기음 0.5 ml의 인슐린 주사기에 1 × 105 개 종양 세포를 함유하는 세포 현탁액 100 ㎕ (29 G 12.7 mm 바늘 길이). </li><li> 2 차 및 3 차 젖꼭지 근처에 엄지 손가락 인덱스를 사용하여 피부를 들어 올려 mammar에 주사기의 바늘을 삽입Y 지방 그냥 손가락 사이의 피부 아래에 세 번째 젖꼭지 아래 패드와 주입 세포는 천천히 거품 (피하 주사)을 형성한다. </li><li> 다시 주입 후 케이지에 마우스를 놓고 1.2.2에서와 같이 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 모니터링 종양 성장 <ol><li> 캘리퍼스 측정 (14) 참고 : 4T1 주조 또는 4T1-GFP 세포는 공격적인 유방 종양을 형성한다. 세포 접종 후 5 - 일반적으로 만져서 알 수있는 종양은 4 일에서 ~ 나타납니다. 4T1-GFP 세포는 느리게 성장하고 나중에 전이를 제공 종양을 형성한다. 종양을 2 ~ 3 배 일주일을 측정합니다. 동물의 임상 적 상태가 악화되면 동물 종양 체중의 10 %를 초과하거나 즉시 마우스를 안락사, 궤양되고, 10 % 이상의 체중을 잃는다. <ol><li> . 1.2.1에서와 같이 마우스를 마취 수술 패드 장소 무게와 70 % 에탄올로 영역을 적시고. </li><li> (- 오일 세포 접종 후 4) 주사 부위에 종양이 만져. </li> &lt;리&gt; 캘리퍼와 가장 큰 직경 (D) 및 작은 직경 (D1)을 측정한다. </li><li> 식 볼륨 = (DX (D1)의 X의 D1) / 2mm 3를 사용하여 종양 체적을 계산합니다. 1.2.2에서와 같이 마취에서 마우스 복구를 모니터링합니다. </li></ol></li><li> 이미징 (전용에 대한 4T1 GFP 세포) <ol><li> 1.2.1와 같이 마우스를 마취. 이미징 기기 내부의 가동 단계에 마우스를 놓습니다. 코 콘을 통해 마취를 유지한다. </li><li> 이미징 기기 및 제조업체의 지침에 따라 광원을 켭니다. </li><li> 탭 &quot;취득&quot;에서 &quot;조명&quot;으로 이동하여 백색광의 빈 위치 (아무 필터)로 전환합니다. 빛 엔진이 켜져 있는지 확인하고 라이트 테이블에 &#39;트랜스&#39;를 선택합니다. </li><li> 탭 &quot;현미경&quot;에서 &quot;지우기&quot;배출 필터와 0.5X 배율을 선택합니다. &quot;카메라&quot;탭에서 캡처 비닝하는 &#39;1 × 1&#39;미리보기 &#39;는 4 × 4&#39;인지 확인하십시오. </l난&gt; <li> 흰색 빛 종양의 위치를​​ 미리보기를 클릭 선명한 영상을 얻을 수 초점을 캡처을 클릭합니다. </li><li> 1 (제조업체의 지시에 따라 GFP에 대한 필터) 필터링 &quot;취득&quot;탭을 변경 조명으로 이동합니다. 은 &quot;현미경&quot;탭에서 &quot;20분의 530의 GF&quot;에 방출 필터를 변경합니다. 녹색 채널의 미리보기 및 캡처 이미지. 적절한 밝기를 얻을 노출 시간을 조정합니다. </li><li> 이미지에 사색을 적용하고 해당 폴더 (그림 1)에 저장합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 리포좀 10 2. 비강 관리 참고 : 달리 명시하지 않는 한 층류 (LAF) 생물 안전 캐비닛에 멸균 솔루션을 사용하여 모든 단계를 수행합니다. <ol><li> 종양 세포 주입 후 6 일째 1.2.1에서와 같이 마우스 마취. </li><li> 제조업체에서 얻은 클로드 또는 제어 (PBS) 리포좀 현탁액을 소용돌이. 리포좀의 μL (60)를 타고uspension 멸균 피펫 팁을 사용. </li><li> 천천히, 마우스 용액에 숨을 쉴 수 있도록 콧 구멍 근처 (5 ㎕를 각 시간) 리포좀 솔루션을 출시 60 μL의 전체 용량이 투여 될 때까지 반복합니다. </li><li> 마우스가 케이지에 다시 배치하기 전에 의식을 회복하자. </li><li> 반복 리포좀 관리는 마우스까지 3 일마다 희생된다. 희생의 날에 리포좀을 관리하지 마십시오. </li></ol> 3. 마우스의 희생과 조직 컬렉션 참고 : 사용 멸균 및 마우스 해부에 대한 무균 악기. 동안 중요한 장기의 방혈 및 제거를 통해 마취 쥐를 안락사. <ol><li> 일 22 또는 일 (4T1 셀) (26) 종양 세포 주입 후 (4T1-GFP 세포) 1.2.1에서와 같이 마우스를 마취. 그리고, 기화기에 연결된 코 콘 수술 패드에 배치 1.2.1에서와 같이 마취를 유지한다. m 개의 않도록 발가락 중 하나를 꼬집어여러개 의식이다. </li><li> 해부 보드에 바늘을 사용하여 발가락을 고정. 마우스 피부에 에탄올을 스프레이. </li><li> 집게를 사용하여 피부를 들어 올려 수술 가위로 절개를합니다. 천천히 복막을 노출하고 목까지 흉부 피부를 통해 절단을 계속합니다. </li><li> 수술 가위를 사용하여 복막에 절개를하고, 혈관의 손상을 방지면 팁 신중 장기 노출. </li><li> 한쪽으로 장기를 이동하고 하대 정맥을 노출. 정맥에 구멍과 29 G 인슐린 주사기로 피를 수집합니다. 튜브에 수집 된 혈액을 놓고 추가 처리를 위해 얼음에 둡니다. </li><li> 흉곽, 폐와 심장을 노출 다이어프램을 잘라. 천천히 뼈 커터를 사용하여 양쪽의 갈비뼈를 잘라 흉곽의 상단을 들어 올립니다. 집게로 마음을 잡고 흉강에 심장과 폐를 연결하는 결합 조직을 잘라. </li><li> 60 mm 단위 PBS 소량의 폐 배치면역 형광 현미경 또는 [헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E) 염색 포함] 루틴 조직학에 대한 동결 절편에 이미징 및 추가 처리를 위해 준비 될 때까지 얼음에 페트리 접시. </li></ol> 4. 폐 전이 평가 <ol><li> 표면 전이 계산 및 채점 <ol><li> 해부 현미경으로 폐와 페트리 접시를 놓습니다. 폐 표면의 밝은 전망을 얻기 위해 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 해부 현미경을 사용하여 폐 표면을 관찰한다. 모두 폐의 전방 및 후방 측면에 전이를 계산합니다. 주 : 정상적인 폐는 약간 흰 또는 분홍빛 및 다공성 구조와 같은 스폰지가 있습니다. 4T1 전이 종종 액체 (도 2A) 한 방울과 유사하게 나타나, 단단하고 비 다공성이다. </li></ol></li><li> 폐 영상 <ol><li> 이미징 기기 내부의 이동식 무대에서 폐와 페트리 접시를 놓습니다. </li><li> 악기와 켭니다멀티 스펙트럼 소스를 biolite. 소프트웨어를 엽니 다. 탭에서, &quot;취득&quot;, &quot;조명&quot;로 이동하여 백색광 빈 위치 (아무 필터)로 전환합니다. 라이트 엔진 -&gt; ON, 라이트 테이블 -&gt; 에피. 탭 &#39;현미경&#39;에서 &#39;지우기&#39;방출 필터와 1.66X 배율을 선택합니다. &quot;카메라&quot;탭에서 캡처 비닝하는 &#39;1 × 1&#39;미리보기 &#39;는 4 × 4&#39;인지 확인하십시오. </li><li> 미리보기를 클릭하고 흰색 빛 폐의 명확한 그림을 얻을 캡처를 클릭하여 초점을 맞 춥니 다. </li><li> (제조업체의 지시에 따라 GFP에 대한 필터) 필터 1 &quot;취득&quot;탭과 변화에 이동합니다. 은 &quot;현미경&quot;탭에서 &quot;20분의 530의 GF&quot;에 방출 필터를 변경합니다. 녹색 채널의 미리보기 및 캡처 이미지. 적절한 밝기를 얻을 노출 시간을 조정합니다. </li><li> 이미지에 사색을 적용하고 해당 폴더에 저장합니다. </li><li> 유사한 방식으로, 다른 쪽의 화상을 얻기 위해 폐 플립. 이 PROCedure 더 적절한 소프트웨어 (그림 2B) (14)를 사용하여 정량화 할 수있다 GFP 양성 전이의 이미지를 생성합니다. </li></ol></li><li> 면역 형광 현미경 <ol><li> 어두운 곳에서 4 시간 동안 4 ℃에서 4 % 파라 포름 알데히드에서 폐 수정. </li><li> 완전히 정착을 제거하기 위해 5 분 동안 10 ml의 PBS로 두 번 조직을 씻으십시오. PBS의 18 % 자당에 전송하고 4 ℃에서 O / N을 품어. </li><li> 자당에서 조직을 제거하고 초과를 줘봐. </li><li> cryomold을 가지고, 간섭 단층 매체와 바닥 층을 커버한다. 간섭 단층 매체에 조직을 놓습니다. 완전히 드라이 아이스의 조직과 장소를 커버하는 간섭 단층 매체와 금형을 입력합니다. </li><li> 절편 때까지 -80 ° C에서 보관 블록. </li><li> 충전 슬라이드에 저온 유지 장치와 장소 5 μm의 두께 섹션을 준비합니다. </li><li> 또한 사용 때까지 -80 ° C에서 사용되지 않는 슬라이드를 저장합니다. </li><li> 공기는 7 분 동안 슬라이드를 건조. 및 OCT를 제거하는 PBS로 세척. WIP전자 조직이나 종이 타월로 슬라이드 물을 초과를 제거 DAPI를 포함하는 매체를 장착하여 커버 슬립을 탑재하고 현미경으로 GFP 필터를 시각화한다. </li><li> 적절한 소프트웨어 (14)의 사용과 GFP 전이 (도 3A)을 정량화. </li></ol></li><li> 조직학 및 디지털 병리학 <ol><li> 시작 탭에서 수동로드 버튼을 클릭하고 스캐너에서 배출 랙을 들고 슬라이드를 기다립니다. </li><li> 의 H &amp; E 염색 조직 절편을 가지고있는 먼지를 제거 티슈로 청소하고, 슬라이드 들고 랙에 안전하게 배치합니다. </li><li> 팝 업 창에서 슬라이드 설명을 입력합니다. </li><li> 친위대 영상 콘솔 창에서 스캔 영역 탭을 선택하고 관심 (ROI)의 영역 스캔 할을 정의 할 수있는 녹색 사각형을 조정합니다. </li><li> 조직이 투자 수익 (ROI) 내에서, 그러나, 결석 슬라이드의 명확한 부분에 푸른 교정 다이아몬드를 드래그합니다. </li><li> 다음으로, 초점 P를 선택oints 탭은 ROI의 조직에 여러 개의 초점 포인트를 얻을 수있는 자동 선택 버튼 (노란색 더하기 기호)를 클릭합니다. </li><li> 필요한 경우, 투자 수익 (ROI) 내에서 두 번 클릭하여 수동으로 추가 초점 포인트를 놓습니다. </li><li> 교정 탭으로 이동하고 푸른 교정 다이아몬드 포인트에서 슬라이드 교정을 시작하기 위해 보정 버튼을 선택합니다. 교정이 완료된 후, 교정 포인트의 이미지가 표시된다. </li><li> 이 명확하고 먼지 나 유물이 없는지 확인하기 위해이 이미지를 검사합니다. </li><li> 스캔 탭으로 이동하고, 투자 수익 (ROI)의 스캔을 시작하기 위해 스캔 시작을 선택합니다. 스캔 조직 학적 섹션은 디지털 슬라이드로 변환된다 (그림 3B 및 4A) </li><li> 이전에 (그림 4B) (14) 설명에 따라 전이성 부담을 정량화. </li></ol></li></ol> 폐의 폐포 대 식세포 5. 유동 세포 계측법 (FACS) 분석 <ol><li> 단일 셀 Suspensi의 준비...에 <ol><li> 이미징 및 전이 계산 한 후, 멸균 PBS로 폐를 씻어 페트리 접시에 놓습니다. 수술 가위와 집게를 사용하여 폐의 2mm 조각 - 1을 확인합니다. </li><li> (3) 1 ㎎ / ㎖의 콜라게나 P, 0.04mg / ㎖의 DNase I을 함유하는 분해 완충액 ㎖, 10 μg의 / ㎖ 트립신 용해 억제제 RPMI 배지 (멸균)과 15ml의 원뿔형 튜브에 폐 조각을 전송. </li><li> 40 분 동안 37 ° C의 배양기에서 회전 진탕 기에서 인큐베이션 원추형 튜브. </li><li> 조직을 떼어 놓다 아래로 인큐베이터에서 튜브 원뿔을 제거하고 솔루션을 피펫합니다. </li><li> 덩어리를 방지하고 단일 세포 현탁액을 얻을 수있는 40 μm의 여과기를 통해 솔루션을 전달합니다. 필요한 경우, 주사기 플런저의 도움으로 셀 스트레이너에 대해 더 잘 소화 조직 프레스 조직을 분해합니다. </li><li> 단일 세포 현탁액이 달성되면, 원심 분리하여 세포를 수집하고으로 적혈구를 용해시키기RT에서 10 분 동안 ACK 완충액 2 ㎖. 그 후, RPMI 8 ml의 펠릿 두 번 세척 하였다. </li><li> 전체 RPMI 배지 3 ㎖와에 재현 탁 전지는 제조업체의 지침에 따라 세포 생존 분석기를 사용하여 계산 셀로 진행합니다. </li></ol></li><li> 표면 마커에 대한 폐 세포의 염색 참고 : 4 ° C에서 모든 배양을 수행합니다. 500 XG, 4 ℃에서 원심 분리기 판. <ol><li> 피펫 V 바닥 96 웰 플레이트의 각각의 웰을 FACS 완충액 (PBS에 1 % FBS) 100 ㎕에 1 × 106 세포. V 자 바닥 96 웰 플레이트를 사용하면 여러 샘플을 나눠을 용이하게한다. </li><li> 1 μg의 마우스와 차단 된 Fc 세포 현탁액을 사전 부화 15 분 동안 FACS 완충액 100 ㎕의 CD32 / 항 - 마우스 CD16 정제. 세포 펠렛과 판을 뒤집기 및 솔루션 드레인을 시켜서 뜨는을 제거하는 V 바닥 96 웰 플레이트를 원심 분리기. </li><li> 표면 얼룩의 경우, 사전에 murin에 대한 항체를 희석하나의 튜브 (마스터 믹스)에 전자 항원 : BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b를 (/ 70 M1), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7의 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I A / 된 Fc 블록 CD16 10 ㎍ / ml를 함유 FACS 완충액 중 2.5 ㎍ / ml의 최종 농도 I E (MHCII) (M5 / 114.152) PE CD80 (16-10A1) AF 647 CD86 (GL-1) / CD32 항독소. 참고 : 항체의이 세트는 식별 및 폐포 대 식세포와 수지상 세포의 기능 상태를 평가하는 데 유용합니다. </li><li> V 자 바닥 96 웰 플레이트에 희석 항체 (마스터 믹스) 100 μl를 추가하고 30 분 동안 4 ℃에서 배양한다. </li><li> 세포 펠렛 및 5.2.2에서와 같이 뜨는을 제거하기 위해 플레이트를 원심 분리기. 5 분 동안 500g에 FACS 버퍼 200 μL, 원심 분리기로 세포를 씻으십시오. 5.2.2에서와 같이 뜨는을 제거합니다. 및 PBS 200 ㎕의 세포를 재현 탁. </li><li> PBS (1,000 일)에 희석 가능성 염료를 세포 펠렛을 추가 할 수있는 판을 원심 분리기. 4 ℃에서 20 분 동안 품어. &lt;/ 리&gt; <li> 세포 펠렛 및 5.2.2에서와 같이 뜨는을 제거 할 수있는 판을 원심 분리기. PBS 200 μL로 세척하고 다시 접시를 원심 분리기. </li><li> FACS 악기에 의해 인수 될 때까지 4 ° C에서 1 % 파라 포름 알데히드 및​​ 저장 100 ㎕에 재현 탁 세포. 폴리 프로필렌 FACS 튜브에 수집 전송 세포 현탁액에 앞서. </li></ol></li></ol> 6. FACS 데이터의 분석 : 게이팅 전략과 세포의 부분 집단의 식별 <ol><li> 이전에 (10)를보고 FACS 분석을 수행합니다. 게이트 셀 포워드 (FSC)을 기반으로 / 이벤트 및 측면 산란 (SSC)를 취득; 다음 라이브 게이트와 CD45 + 세포. 폐포 대 식세포 식별, 게이트 부정적인 CD11b를-다음의 CD11c + F4 / 80 + 세포. (도 5a). </li></ol>

<ol>
	<li>Sceneay, J., Smyth, M. J., Moller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pre-metastatic+niche:+finding+common+ground.">The pre-metastatic niche: finding common ground.</a> Cancer Metastasis Rev. , (2013).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+cancer+metastasis:+the+'seed+and+soil'+hypothesis+revisited.">The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited.</a> Nat Rev Cancer. 3, 453-458 (2003).</li><li>Kaplan, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR1-positive+haematopoietic+bone+marrow+progenitors+initiate+the+pre-metastatic+niche.">VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche.</a> Nature. 438, 820-827 (2005).</li><li>Hiratsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP9+induction+by+vascular+endothelial+growth+factor+receptor-1+is+involved+in+lung-specific+metastasis.">MMP9 induction by vascular endothelial growth factor receptor-1 is involved in lung-specific metastasis.</a> Cancer Cell. 2, 289-300 (2002).</li><li>Hiratsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+S100A8-serum+amyloid+A3-TLR4+paracrine+cascade+establishes+a+pre-metastatic+phase.">The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase.</a> Nat Cell Biol. 10, 1349-1355 (2008).</li><li>Yan, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gr-1+CD11b++myeloid+cells+tip+the+balance+of+immune+protection+to+tumor+promotion+in+the+premetastatic+lung.">Gr-1+CD11b+ myeloid cells tip the balance of immune protection to tumor promotion in the premetastatic lung.</a> Cancer Res. 70, 6139-6149 (2010).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+progenitor+cells+in+the+premetastatic+lung+promote+metastases+by+inducing+mesenchymal+to+epithelial+transition.">Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition.</a> Cancer Res. 72, 1384-1394 (2012).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nat Immunol. 14, 986-995 (2013).</li><li>Holt, P. G., Strickland, D. H., Wikstrom, M. E., Jahnsen, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+immunological+homeostasis+in+the+respiratory+tract.">Regulation of immunological homeostasis in the respiratory tract.</a> Nat Rev Immunol. 8, 142-152 (2008).</li><li>Sharma, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+alveolar+macrophages+contribute+to+the+premetastatic+niche+by+suppressing+antitumor+T+cell+responses+in+the+lungs.">Pulmonary alveolar macrophages contribute to the premetastatic niche by suppressing antitumor T cell responses in the lungs.</a> J. Immunol. 194, 5529-5538 (2015).</li><li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+4T1+breast+tumor+model.">Mouse 4T1 breast tumor model.</a> Current protocols in immunology. , (2001).</li><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127, 679-695 (2006).</li><li>Buiting, A. M., Van Rooijen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+mediated+depletion+of+macrophages:+an+approach+for+fundamental+studies.">Liposome mediated depletion of macrophages: an approach for fundamental studies.</a> J. Drug Target. 2, 357-362 (1994).</li><li>Vadrevu, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+c5a+receptor+facilitates+cancer+metastasis+by+altering+T-cell+responses+in+the+metastatic+niche.">Complement c5a receptor facilitates cancer metastasis by altering T-cell responses in the metastatic niche.</a> Cancer Res. 74, 3454-3465 (2014).</li><li>Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+research.">Genetically engineered mouse models in cancer research.</a> Adv. Cancer Res. 106, 113-164 (2010).</li><li>Bosiljcic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+suppressor+cells+regulate+the+lung+environment--letter.">Myeloid suppressor cells regulate the lung environment--letter.</a> Cancer Res. 71, 5050-5051 (2011).</li><li>Yan, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Suppressor+Cells+Regulate+the+Lung+Environment-Response.">Myeloid Suppressor Cells Regulate the Lung Environment-Response.</a> Cancer Res. 71, 5052-5053 (2011).</li><li>Van Rooijen, N., Sanders, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+mediated+depletion+of+macrophages:+mechanism+of+action,+preparation+of+liposomes+and+applications.">Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications.</a> J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

The recent insights into cancer biology and causative factors involved in carcinogenesis and tumor progression lead to development of genetically engineered mouse (GEM) models of cancer, in which tumors grow spontaneously, usually over a period of several months15. Although these tumor models appear to reflect better the natural history of human malignancies than xenografts or syngeneic models, much time required for tumor development and various degrees of malignant phenotype penetrance limit the use of these...

The premetastatic niche is an important process in cancer metastasis defined as a set of alterations that occur in the organs that are targets for metastases prior to arrival of tumor cells1,2. Therefore, therapeutic targeting of this step of cancer progression may prevent metastases to the vital organs that cause approximately 90% of cancer-associated deaths. Although the concept of the premetastatic niche, also known as the "seed and soil" theory, was introduced more than a century ago, no experimental proof has been provided until recently, when the bone marrow-derived cells were demonstrated to contribute to the premetastatic soil1,3-7. Despite these developments, the premetastatic niche remains a largely understudied aspect of cancer pathophysiology and further research to identify cellular players and mechanisms involved is needed. 
Here we report the in vivo approaches to study the role of alveolar macrophages in breast cancer metastases and the lung premetastatic niche. The alveolar macrophages arrive to the lungs early during the embryonic development and self-renew there during adulthood8. They also have important immunomodulatory and homeostatic functions including the protection of this organ from undesired inflammatory responses to the environmental innocuous antigens9. Therefore, we hypothesize that tumors exploit this physiological immunosuppression, imposed by alveolar macrophages, and, consequently, alveolar macrophages contribute to the lung premetastatic niche by suppressing antitumor immunity. This hypothesis is supported by our recent report demonstrating that the specific depletion of these cells reduces lung metastases and enhances antitumor T cell responses10. 
For these studies we apply a well-established syngeneic model of breast cancer (4T1), which mimics stage IV metastatic breast cancer11; and has been previously reported in studies of the premetastatic niche6. To track metastasizing tumor cells in vivo we use 4T1 cells expressing GFP (4T1-GFP) in conjunction with animal imaging and confocal microscopy. We focus on the lung premetastatic niche, since this organ is one of the most common targets of hematogenous metastases of human malignancies12. To investigate functions of alveolar macrophages in the premetastatic niche, we use clodronate liposomes to deplete these cells13; and evaluate impact of this depletion on lung metastases. Of note, this method specifically depletes alveolar macrophages but no other phagocytic cells in the lungs or in circulation10.

<table><tbody><tr><td>4T1 cell line&amp;nbsp;</td><td>American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA</td><td>CRL 2539</td><td>Tumor cells</td></tr><tr><td>4T1-GFP cell line</td><td>Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA</td><td>BW128090</td><td>Tumor cells</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning, Corning, NY, USA</td><td>10-040-CM</td><td>Media</td></tr><tr><td>Heat inactivated FBS</td><td>Gibco (Thermo Scientific), USA</td><td>10082147</td><td>Media</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>MT-300-02-CI</td><td>Media</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>BP399-20</td><td>Dilute with distilled water</td></tr><tr><td>Trypsin 0.25% with EDTA</td><td>Hyclone, Logan, Utah, USA</td><td>SH30042.02</td><td>Tissue culture supplies</td></tr><tr><td>T75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; flask</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>12-565-32</td><td>Tissue culture supplies</td></tr><tr><td>15 ml conical tube</td><td>BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>352096</td><td>Tissue culture supplies</td></tr><tr><td>50 ml conical tube</td><td>BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>352098</td><td>Tissue culture supplies</td></tr><tr><td>60 mm2 Petri dish</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>AS4052</td><td>For lung imaging&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurane (Isothesia)</td><td>Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>Mouse anesthesia</td></tr><tr><td>Clodronate liposomes</td><td>Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA</td><td>F70101C-N</td><td>Macrophages depletion</td></tr><tr><td>Control liposomes</td><td>Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA</td><td>F70101-N</td><td>Control PBS-liposomes</td></tr><tr><td>29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On</td><td>Walmart, Bentonville, AR, USA</td><td></td><td>For tumor cell injection</td></tr><tr><td>Hair removal cream (Nair)</td><td>Walmart, Bentonville, AR, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde solution (4%)</td><td>Affymetrix, Santa Clara, CA, USA</td><td>19943-I Lt</td><td>Dilute to 4% or 1% using 1x PBS</td></tr><tr><td>OCT compound</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>230-730-571</td><td>For freezing tissue in cryomolds</td></tr><tr><td>Fluoro-Gel-II with DAPI</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>17985-51</td><td>Mounting medium</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>S-9378</td><td>Cryopreservation</td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche, Basel, Switzerland</td><td>11249002001</td><td>Components of tissue digestion buffer</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche, Basel, Switzerland</td><td>10104159001</td><td>Components of tissue digestion buffer</td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>T9253</td><td>Components of tissue digestion buffer</td></tr><tr><td>40 micron cell strainers</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>22-363-547</td><td>Used in tissue digestion to remove clumps</td></tr><tr><td>Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32)</td><td>Biolegend, San Diego, CA, USA</td><td>101320</td><td>Antibodies for flow cytometry</td></tr><tr><td>BV605 CD45</td><td>Biolegend, San Diego, CA, USA</td><td>103139</td><td>Antibodies for flow cytometry</td></tr><tr><td>PE CD11b</td><td>Biolegend, San Diego, CA, USA</td><td>101207</td><td>Antibodies for flow cytometry</td></tr><tr><td>PE Cy7 F4/80&amp;nbsp;</td><td>Biolegend, San Diego, CA, USA</td><td>123113</td><td>Antibodies for flow cytometry</td></tr><tr><td>APC/Cy7 CD11c</td><td>Biolegend, San Diego, CA, USA</td><td>117323</td><td>Antibodies for flow cytometry</td></tr><tr><td>PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII)&amp;nbsp;</td><td>Biolegend, San Diego, CA, USA</td><td>107625</td><td>Antibodies for flow cytometry</td></tr><tr><td>PE CD80</td><td>Biolegend, San Diego, CA, USA</td><td>104707</td><td>Antibodies for flow cytometry</td></tr><tr><td>AF647 CD86</td><td>Biolegend, San Diego, CA, USA</td><td>105019</td><td>Antibodies for flow cytometry</td></tr><tr><td>Fixable viability Dye eflour 506</td><td>eBioscience, San Diego, CA,USA</td><td>65-0866</td><td>Antibodies for flow cytometry</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA</td><td>CM1850</td><td>Cryosectioning</td></tr><tr><td>UVP iBox Explorer</td><td>UVP Inc, Upland, CA, USA</td><td></td><td>Mouse and lung fluorescent imaging</td></tr><tr><td>Aperio Scanscope CS</td><td>Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA</td><td></td><td>Digital pathology</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td></td><td>Flow cytometry/data acquisition</td></tr><tr><td>Nikon A1 confocal TE2000 microscope</td><td>Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.</td><td></td><td>Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections</td></tr><tr><td>UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38)</td><td>UVP Inc, Upland, CA, USA</td><td></td><td>Imaging software for iBOX</td></tr><tr><td>Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029)&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA</td><td></td><td>Imaging software for analysis of digital slides</td></tr><tr><td>Flow JO software (version 9.8.1)</td><td>Flow JO LLC, Ashland, OR, USA</td><td></td><td>Analysis of flow cytometric data</td></tr><tr><td>NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit</td><td>Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.</td><td></td><td>Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

studying the role of alveolar macrophages in breast cancer metastasis

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

전이가 빠르게 폐 (도 2), 간, 뼈 형성으로 유방 지방 패드로 4T1-GFP 종양 세포의 주입은, 인간 유방암 전이 확산 요점을 되풀이 마우스 종양 (도 1a)의 형성을 유도 와 마우스 (11)의 뇌. GFP와 4T1 세포의 안정한 형질 감염은 종양 성장의 모니터링을 용이하게한다 (도 1B), 전이되는 종양 세포의 추적 및 전이성 부담 (도 2B, 3B)을...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis at JoVE.com

Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

유방암 전이에 폐포 대 식세포의 역할을 공부

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer ...

studying-the-role-of-alveolar-macrophages-in-breast-cancer-metastasis

Research

JoVE Journal

Medicine

9.7K 조회수.  Texas Tech University Health Science Center. Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used. 

비디오: Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

현미경 뼈 전이의 효율적이고 선택적 모델링을위한 내부 장골 동맥 주입

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

연구

암 연구학

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, thus greatly influencing normal tissue homeostasis and disease outcome. In breast cancer, tumor-associated macrophages (TAMs) play a critical role in disease progression, metastasis, and recurrence; therefore, understanding the mechanisms of monocyte chemoattraction to the tumor microenvironment and their interactions with tumor cells is important to control the disease. Here, we provide a detailed description of a three-dimensional (3D) co-culture system of human breast cancer (BrC) cells and human monocytes. BrC cells produced high basal levels of regulated on-activation, normal T-cell expressed and secreted (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (G-CSF), while in co-culture with monocytes, pro-inflammatory cytokines Interleukin (IL)-1 beta (IL-1&#946;) and IL-8 were enriched together with matrix metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, and MMP-10. This tumor stroma microenvironment promoted resistance to anoikis in MCF-10A 3D acini-like structures, chemoattraction of monocytes, and invasion of aggressive BrC cells. The protocols presented here provide an affordable alternative to study intra-tumor communication and are an example of the great potential that in vitro 3D cell systems provide to interrogate specific features of tumor biology related to tumor aggression.

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Here, we describe a three-dimensional culture method to analyze the morphology of primary breast cancer cells, as well as to study their direct/indirect interactions with monocytes and the outcomes such as collagen degradation, immune cell recruitment, cell invasion, and promotion of cancer-related inflammation.

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful immunotherapies. Several studies have indicated that tumor infiltrating myeloid cells (e.g., myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) and tumor-associated macrophages (TAMs)) suppress cytotoxicity of CD8+ T cells in the tumor microenvironment, and that targeting these regulatory myeloid cells can improve immunotherapies. Here, we present an in vitro assay system to evaluate immune suppressive effects of monocytic-MDSCs and TAMs on the tumor-killing ability of CD8+ T cells. To this end, we first cultured na&#239;ve splenic CD8+ T cells with anti-CD3/CD28 activating antibodies in the presence or absence of suppressor cells, and then co-cultured the pre-activated T cells with target cancer cells in the presence of a fluorogenic caspase-3 substrate. Fluorescence from the substrate in cancer cells was detected by real-time fluorescence microscopy as an indicator of T-cell induced tumor cell apoptosis. In this assay, we can successfully detect the increase of tumor cell apoptosis by CD8+ T cells and its suppression by pre-culture with TAMs or MDSCs. This functional assay is useful for investigating CD8+ T cell suppression mechanisms by regulatory myeloid cells and identifying druggable targets to overcome it via high throughput screening.

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

We describe here a protocol to investigate cytotoxicity of pre-activated CD8+ T cells against cancer cells by detecting apoptotic cancer cells via real-time microscopy. This protocol can investigate mechanisms behind myeloid cell-induced T cell suppression and evaluate compounds aimed at replenishing T cells via blockade of immune suppressive myeloid cells.

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary sites. Recently, we established that cancer cell dissemination in primary breast cancer and at metastatic sites in the lung occurs only at doorways called Tumor MicroEnvironment of Metastasis (TMEM). TMEM doorway number is prognostic for distant recurrence of metastatic disease in breast cancer patients. TMEM doorways are composed of a cancer cell which over-expresses the actin regulatory protein Mena in direct contact with a perivascular, proangiogenic macrophage which expresses high levels of TIE2 and VEGF, where both of these cells are tightly bound to a blood vessel endothelial cell. Cancer cells can intravasate through TMEM doorways due to transient vascular permeability orchestrated by the joint activity of the TMEM-associated macrophage and the TMEM-associated Mena-expressing cancer cell. In this manuscript, we describe two methods for assessment of TMEM-mediated transient vascular permeability: intravital imaging and fixed tissue immunofluorescence. Although both methods have their advantages and disadvantages, combining the two may provide the most complete analyses of TMEM-mediated vascular permeability as well as microenvironmental prerequisites for TMEM function. Since the metastatic process in breast cancer, and possibly other types of cancer, involves cancer cell dissemination via TMEM doorways, it is essential to employ well established methods for the analysis of the TMEM doorway activity. The two methods described here provide a comprehensive approach to the analysis of TMEM doorway activity, either in na&#239;ve or pharmacologically treated animals, which is of paramount importance for pre-clinical trials of agents that prevent cancer cell dissemination via TMEM.

We describe two methods for assessing transient vascular permeability associated with tumor microenvironment of metastasis (TMEM) doorway function and cancer cell intravasation using intravenous injection of high-molecular weight (155 kDa) dextran in mice. The methods include intravital imaging in live animals and fixed tissue analysis using immunofluorescence.

세포 내 이미징 및 고정 조직 분석을 사용하여 암 세포 보급과 관련된 전이 의 종양 미세 환경 평가

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

면역학 및 감염병학

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

배양 인간의 대퇴골 조직 외식하는 방법은 전이성 틈새의 유방암 세포 집락을 연구하기 위해

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

의학

<meta charset="utf8"></head><body>3D 콜라겐 매트릭스 설정에서 대식세포-종양 스페로이드 상호 작용 검사

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

유방암 전이에 폐포 대 식세포의 역할을 공부

요약

더 많은 비디오 탐색

현미경 뼈 전이의 효율적이고 선택적 모델링을위한 내부 장골 동맥 주입

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된⁺ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

세포 내 이미징 및 고정 조직 분석을 사용하여 암 세포 보급과 관련된 전이 의 종양 미세 환경 평가

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

배양 인간의 대퇴골 조직 외식하는 방법은 전이성 틈새의 유방암 세포 집락을 연구하기 위해

대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석