여기에 설명된 프로토콜은 기준 공기 오염 물질 오존에 노출 된 후 폐 대식세포 효능을 측정합니다. 이러한 데이터는 오존 노출이 폐포 대식세포증을 감소시키고 따라서 오존의 높은 수준이 폐 질환의 발생률을 증가시키는 이유에 대한 메커니즘이 될 수 있음을 나타냅니다. 이 기술의 주요 장점은 자신의 표현형 또는 기능을 변경할 수 있는 대식세포의 전 생체 조작 없이 폐포 대식세포 의 생체 내 평가를 허용한다는 것입니다.
이 기술은 폐가 대기 오염 노출 후에 자체를 복구할 수 없는 새로운 기계장치를 밝혔습니다. 추가적으로, 이 기술은 폐에 있는 efferocytosis를 변경하는 표적에 새로운 통로를 드러낼 수 있습니다. 이 방법은 폐 손상 또는 염증의 모든 모델에 적용 될 수있다.
그러나, 사용자는 폐 부상 다음 efferocytosis를 평가하는 것이 가장 좋습니다 때 최적화해야합니다. 구인공포증을 수행하는 것은 기술적으로 어려울 수 있습니다. 수의학 직원과 협력하여 이 절차를 수행하기 위해 기술을 최적화했는지 확인하는 것이 좋습니다.
기저 세포 배양 배지에서 Jurkat T 세포를 배양하여 시작하여 37°C와 이산화탄소 5%의 원고 방향에 따라 보충됩니다. Jurkat T 세포는 3 일마다 미리 따뜻해질 수 있는 배양 매체로 통과를 통해 유지 될 수 있는 현탁액 세포주입니다. 월화 후 3~4일이 걸리는 90%의 합류로 성장시켜 세포를 준비한다.
5개의 T75 플라스크에서 세포를 성장하여 이 프로토콜에 대한 충분한 수의 세포를 얻습니다. 세포가 준비되면 플라스크 내용물 약 24 밀리리터를 흡인하고 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮기십시오. Trypan Blue 염색 및 혈종계를 사용하여 세포를 계산합니다.
5 분 동안 271 배 g에서 원심 분리에 의해 세포를 펠렛하고 상체를 폐기하십시오. 그런 다음, 밀리리터 당 3백만 개의 세포를 얻기 위해 매체에서 세포를 다시 중단합니다. Aliquot 100 by 20 밀리미터 조직 배양 접시 당 5 밀리 리터의 세포를 전송 하 여.
약 9개의 문화 요리를 준비합니다. 한 접시를 노출되지 않은 컨트롤로 따로 놓고 나머지 요리를 UV에 노출시합니다. 에너지 버튼을 누르고 숫자 패드로 600을 입력하여 UV 크로스링커를 올바른 에너지 레벨로 설정합니다. 자외선 노출 시 조직 배양 접시의 상단 커버를 제거하도록 하는 대조군을 제외한 모든 요리를 세포와 함께 조사한다.
그런 다음 세포 배양 인큐베이터의 모든 요리를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 4시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 조사된 모든 세포를 50밀리리터 원전 튜브로 결합하고 5분 동안 271회 g에서 원심분리로 펠릿을 넣습니다. 상체를 버리고 멸균 PBS의 24 밀리리터에서 세포를 다시 중단하십시오.
튜브를 다시 원심 분리하고 상체를 제거합니다. 적절한 농도에서 PBS에서 이를 재중단하여 마우스를 포약하기 위한 세포를 준비한다. 마우스가 제대로 마취되면 반 억류 된 척추 위치에 놓습니다.
경사아크릴 시트 보드에 못 사이에 묶여 수술 문자열을 사용하여 상악 절개에 의해 마우스를 일시 중단합니다. 무딘 비능성 집게를 사용하여 마우스 혀를 가볍게 잡고 당기고 P200 파이펫으로 구술 구멍에 세포에 주입하십시오. 마우스가 복용량을 받은 후 1~2초 동안 딱딱거리는 소음을 낼 때 투약이 성공합니다.
장갑을 낀 손가락으로 혀가 후퇴하는 동안 마우스의 코를 부드럽게 덮습니다. 구강에서 액체가 보이지 않고 마우스가 두 개 이상의 흡입을 취할 때까지 코를 덮어 두십시오. 접종 보드에서 마우스를 제거하고 마취에서 복구 할 수 있도록 케이지에 반환하여 이물질이 나레를 막지 못하도록 마우스를 등에 배치하십시오.
모든 마우스가 마취에서 깨어난 후 폐포 대식세포가 세포 유입을 삼키도록 90분 간 기다립니다. 용액을 수집하려면 원고 의 방향에 따라 안락사 된 마우스를 준비하십시오. PBS를 폐로 천천히 밀어 들어 팽창한 다음 동일한 볼륨을 다시 당겨 PBS가 콧구멍을 빠져나오지 않도록 합니다.
15 밀리리터 튜브에서 각 마우스에서 풀로 된 용암을 수집합니다. 기관지 알팔포라 라베이지 또는 BAL을 섭씨 4도에서 6분간 610회 g로 원심분리하고, 1.5밀리리터 튜브로 상류관을 수집하고 영하 80도에서 동결합니다. 펠릿은 기관지포 공간으로부터의 세포를 나타낸다.
잔류적 혈전세포를 제거하기 위해 펠릿에 ACK 적혈구 용해 버퍼 1밀리리터를 넣습니다. 소용돌이와 얼음에 1 분 동안 lyse, 다음 리스 반응을 중지 PBS의 네 밀리리터를 추가합니다. 섭씨 4도에서 6분간 610배 g의 원심분리하고 진공 흡인제로 상퍼를 흡인합니다.
그런 다음, 10%의 FBS로 PBS의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 Trypan Blue 없이 혈전계에 세포를 계산합니다. 심중기 가속및 세포원심분리기를 사용하여 3분 동안 12배 g의 슬라이드에 각 샘플의 원심분리기 120 마이크로리터. 슬라이드를 하룻밤 동안 말리십시오.
다음 날, 혈소시린과 에오신으로 슬라이드를 얼룩지게하여 비페로세포 및 차동 세포 수를 모두 계산합니다. 그런 다음 20X 또는 40X 목표를 사용하여 생물학적 현미경에 대한 브라이트필드 설정 하에서 슬라이드를 봅니다. 각 슬라이드에서 적어도 200 개의 세포를 계산하도록 하는 세포 세포가 폐포 세포에 대식세포에 대한 폐포 세포인 폐포 대식세포의 비율을 기준으로 효능 지수를 계산합니다.
이 프로토콜은 폐 염증에 오존 노출의 효과를 조사하는 데 사용되었다. 오존 노출 마우스는 여과된 공기 제어 그룹에 비해 공공간에서 대식세포 및 호중구의 증가를 표시하고 BAL 단백질의 증가를 했다, 폐포 상피 기능 장애의 마커. 마우스를 투약하기 전에, Jurkat T 세포에 있는 세포세포는 유동 세포측정으로 확인되었습니다.
60 밀리 주전자 UV 노출 수준과 4 시간 잠복 기 약 75%의 세포 세포의 반복적인 결과 결과. 에페로세포대식세포는 일반 폐포 대식세포에 비해 Jurkat T 세포를 덮은 대식세포로 확인되었다. 오존 유도폐 염증이 세포 의 감소 간격과 연관되어 있음을 나타내는 여과된 공기 조절군에 비해 오존 노출 군의 효능 지수가 현저한 감소가 있었다.
세부 사항에 주의하고 관찰 된 차이점을 기록하는 것은이 절차 중에 중요합니다. 또한 분석을 위해 샘플을 블라인드하고 두 명의 다른 사람이 대식세포수를 계산하는 것이 좋습니다. 격리 후, BAL 세포는 mRNA 분석을 위해 사용될 수 있고, 면역 형광에 의한 추가 마커를 위해 염색하고, /또는 현상변 변화를 구별하기 위해 유동 세포계에서 실행될 수 있다.
