이 표준화 프로토콜 세트는 최근 개발 중인 눈의 우수한 안구 황액 또는 SOS에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 프로토콜은 전 세계의 모든 실험자가 제브라피시 눈 발달 중에 SOS를 명확하게 시각화할 수 있도록 합니다. 이종화 구스 성장 분화 인자 6 A 남성과 여성 얼룩말 피쉬를 분리기의 분리 된 측면에 배치하여 그들의 페어링 전날 저녁에 탈염 된 물 탱크에.
다음 아침, 칸막이를 제거하고 물고기가 30 분 이상 번식 할 수 있습니다. 번식 기간이 끝나면 배아를 28.5도 인큐베이터에서 배양용 E3 배지를 함유한 페트리 접시에 배아를 수집합니다. 20시간 후 수정시, 상피제를 E3 배지로 대체하여 0.004%1-페닐-2-티우레아를 보충하여 안료 생산을 방지하고 경현미경으로 배아를 검사하여 모두 적절한 발달 단계에 있는지 확인한다.
샘플을 해부 현미경 아래에 놓습니다. 발달미태아를 버리고 미세한 집게를 사용하여 치리온을 부드럽게 떼어냅니다. 눈의 등부 여백에서 들여쓰기 또는 선으로 나타날 수 있는 SOS를 시각화합니다.
그런 다음 SOS 폐쇄 지연을 보이지 않는 배아를 정렬합니다. 해부 현미경을 사용하여 이러한 배아를 촬영하려면 E3 배지에서 1%아가로즈를 함유한 페트리 접시를 준비하고 아가로즈 의 중심을 가볍게 찌르면 배아의 노른자를 배치할 수 있는 얕은 구멍을 만듭니다. 그런 다음 마취된 배아를 아가로즈위에 측면으로 놓습니다.
화합물 또는 공초점 현미경을 사용하여 배아를 이미지하기 위해, 비겔1%의 작은 볼루스를 포함하는 35mm 페트리 접시로 배아를 E3 배지로 옮기고 미세 낚시 라인을 사용하여 배아를 측면 위치에 신속하게 배치한다. 아가로즈가 식으면 아가로즈를 덮기 위해 충분한 E3 배지를 접시에 부어 20배의 물 침수 목적 렌즈를 사용하여 SOS를 시각화합니다. 이미징 후, 부드럽게 배아에서 아가로즈를 당기고 4 %의 파라 포름 알데히드에 조직을 고정하거나 제브라피쉬가 개발을 계속할 수 있도록합니다.
형광 mRNA 발현에 의해 SOS를 시각화하려면, 1 세포 단계에서 배아에 향상된 GFP-CAX mRNA의 300 피코그램을 주입하는 미세 주입 장치를 사용합니다. 그런 다음, 형광 성 입체코프를 사용하여 밝은 향상된 GFP 발현을 가진 배아를 검사하고 입증된 바와 같이 이미징 방법 중 하나에 의해 배아의 이미지를 얻습니다. 배아 제브라피시 라미닌의 전산 면역형 염색의 경우, 입증된 바와 같이 배아를 비우고 실온 셰이커에서 2시간 동안 신선하게 준비된 4%파라포름알데히드의 미세센트심분리기 튜브에서 배아를 수정합니다.
고정의 끝에서, PBS 플러스 Tween, 또는 PBST에서 배아를 4 번 세척한 다음 실온에서 밀리리터 당 10 마이크로 그램 또는 Proteinase K에서 투과화를 5 분 동안 세척당 5 분 동안 세척합니다. PBST에서 4회 퍼미빌화된 배아를 세척하고 실온 셰이커에서 1~2시간 동안 PBST에 있는 소 혈청 알부민의 밀리리터당 5%의 염소 세럼과 2밀리그램으로 배아를 차단합니다. 차단 인큐베이션의 끝에서, 셰이커에 하룻밤 섭씨 4도에서 관심의 1 차적인 항 라미닌 항체에 있는 배아를 배양합니다.
다음 아침, PBST에서 배아를 세척 당 15 분 동안 5 번 씻고 빛으로부터 보호 되는 셰이커에 섭씨 4도에서 하룻밤 적절한 이차 항체로 조직을 라벨. 다음 아침, PBST에서 배아를 세척 당 15 분 동안 4 번 씻고 신선한 PBST가 들어있는 작은 페트리 접시에 배아를 놓습니다. 미세 한 집게를 사용 하 여, 부드럽게 노 른 자를 방해 하 고 노 른 자 낭의 가벼운 긁어 통해 노 른 자 세포를 제거.
DEyolked 배아를 PBS에서 갓 준비된 30% 글리세롤로 옮기고, 배아를 용액 위에 놓고 가능한 한 이전 용액을 거의 옮기고 배아가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 기다립니다. 배아가 용기의 바닥에 도달하면, PBS 솔루션에서 순차적으로 50%와 70%의 글리세롤로 옮기는 것만으로도 그냥 입증된 것처럼. 배아가 70% 글리세롤 용기의 바닥에 침몰한 후 샘플을 작은 플라스틱 접시로 옮겨 해부를 위해 배아를 뒷뇌로 분리합니다.
미세 해부 도구를 사용하여 한 쪽 머리를 가능한 한 적은 글리세롤이 있는 유리 슬라이드로 이동하고 미세미누티엔 핀을 내부에서 뇌 심실에 부드럽게 삽입하여 머리의 오른쪽과 왼쪽 절반을 서로 분리합니다. 머리가 미드라인 아래로 완전히 채워지면 머리의 양쪽을 중간라인 아래로, 눈쪽을 위로 올려다보세요. SOS는 20~23시간 후 의 해부 현미경을 통해 관찰할 수 있으며, 개발망막의 비강과 측두엽을 분리하는 등쪽 눈의 얇은 선으로서 차동 간섭 조영영상을 통해 관찰할 수 있다.
또한, 눈의 등대 경계에서 미묘한 들여쓰기가 보일 수 있다. 라미닌의 면역형광 염색에 이어, 얇은 선은 지하 막으로 확인될 수 있다. SOS 폐쇄가 지연되면, 그것의 장기간된 존재는 해부 현미경의 밑에 눈의 등쪽쪽에 뚜렷한 갈라짐으로 관찰될 수 있습니다.
차동 간섭 대비 영상을 사용하여 복합 현미경으로 관찰될 때, 이 특징은 등쪽 눈의 선으로 명확하게 보이는 SOS에 의해 분리된 눈의 비강 및 측두측으로 더욱 두드러지게 합니다. 야생형 제브라피시의 후28시간 후 수정으로 라미닌 얼룩은 SOS가 완전히 폐쇄되어 균열 폐쇄 지연을 모니터링하기에 이상적인 단계라는 것을 분명하게 보여줍니다. 향상된 GFP-CAX mRNA의 주사는 SOS 폐쇄로 이끌어 내는 세포의 형태에 있는 변경을 추적하기 위한 살아 있거나 고정된 태아의 세포막의 시각화를 허용합니다.
SOS를 시각화하는 것은 좁고 일시적이기 때문에 어려울 수 있습니다. 그러나 이후 시점에서 클로저 지연을 평가할 때 일관된 채점 방법을 유지해야 합니다. 이 기술은 적당한 SOS 형성 및 폐쇄에 영향을 미치는 유전 요인 또는 약리학 에이전트를 확인하기 위한 실험적인 조작과 결합될 수 있습니다.
