ddTRAP 분석법은 세포에서 텔로머라아제 효소 활성의 민감하고 견고하며 정량적 측정을 얻을 수 있는 능력을 제공합니다. 중간 처리량 방식으로 실행당 최대 96개의 샘플을 실행할 수 있는 능력은 우리에게 큰 이점을 제공합니다. 수집된 데이터에 대한 적절한 통계 분석을 위해 컨트롤과 복제를 실행할 수 있습니다.
셀 리싱 직전에 NP-40 용해 버퍼의 냉동 알리쿼트를 해동하십시오. 해동되면 리시스 버퍼를 얼음 위에 놓습니다. NP-40 용해 버퍼에 PMSF 프로테아제 억제제를 추가하여 최종 농도0.2 밀리머에 도달합니다.
그런 다음, 세포 펠릿을 함유하는 튜브에 40마이크로리터를 추가하여 마이크로리터당 25, 000 세포의 세포 동등성에 도달한다. 부드럽게 세포를 열수 있도록 위아래로 lysate를 피펫. 거품을 하지 않도록 노력하십시오.
세포가 30분 동안 얼음에 대고 감아 두도록 합니다. 10분마다 부드럽게 소용돌이어 세포 파편이 형성되는 것을 방지합니다. 세포 용해 동안, 텔로머라제 연장 반응을 위해 마이크로 센심 분리기 튜브에 마스터 믹스를 준비하고 얼음에 저장합니다.
셀 리시스 후, 익스텐션 마스터의 파이펫 48 마이크로리터가 각 PCR 튜브에 혼합됩니다. 각 PCR 튜브에 희석 된 용액의 2 마이크로 리터를 추가하여 마이크로 리터 당 50 세포의 최종 세포 동등성에 도달하고 원고에 따라 텔로머라아제 확장 반응을 계속합니다. ddTRAP에 대한 미세 원심 분리기 튜브에 마스터 믹스를 준비하고 실온에서 유지합니다.
각 PCR 튜브에 ddPCR 마스터 믹스의 파이펫 19.8 마이크로 리터. 각 튜브에 이전 확장 반응 용액의 2.2 마이크로리터를 추가하여 총 22마이크로리터를 남깁니다. 액적 생성 카트리지를 설정하려면 준비된 용액의 20 마이크로리터를 카트리지의 중간 샘플에 잘 로드합니다.
카트리지의 측면을 부드럽게 탭하여 거품을 솔루션 상단으로 이동합니다. 카트리지의 모든 우물은 오일을 적재하기 전에 시료로 적재해야 합니다. 그런 다음 70 마이크로리터의 액적 생성 오일을 왼쪽 오일에 잘 넣습니다.
카트리지 의 끝에 밧줄로 개스킷을 고정하고 적재되고 조립된 카트리지를 물방울 발생기에 배치합니다. 생성기는 카트리지가 제대로 배치된다는 것을 알리는 단단한 녹색 표시등을 표시합니다. 60~90초 후에 발전기 표시등이 깜박임이 중지되면 주기가 완료됩니다.
이제 카트리지를 제거합니다. 카트리지에서 개스킷을 부드럽게 제거합니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 오른쪽에서 새로 생성된 액적 약 40마이크로리터를 96웰 PCR 플레이트로 피펫합니다.
모든 샘플이 증발을 방지하기 위해 96 웰 플레이트에 로드되면 알루미늄 호일 PCR 플레이트 씰로 플레이트를 열 밀봉합니다. 그런 다음 96웰 플레이트를 열순환기로 로드하여 PCR 반응을 수행합니다. 시작하려면 96웰 플레이트를 액적 판독기로 로드합니다.
A1 샘플이 홀더의 샘플과 일치되도록 플레이트를 올바르게 방향을 지정합니다. 물방울 판독기와 연결된 소프트웨어를 엽니다. 첫 번째 우물 A01을 두 번 클릭하여 샘플 웰 편집기 화면을 엽니다.
실험을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 사용할 분석 유형을 선택합니다. QX200 ddPCR 에바그린 슈퍼믹스를 올바른 감지 방법으로 선택합니다. 웰 편집기 화면의 오른쪽 아래쪽에 적용을 클릭하여 강조 표시된 모든 우물에 사용자 정의 설정을 저장합니다.
다음으로, 웰 편집기 화면에서 대상을 클릭하고 대상 드롭다운 메뉴를 클릭하여 알 수 없음, 참조 또는 템플릿 없음 컨트롤을 선택하여 샘플 유형을 정의합니다. 샘플 이름 섹션에서 모든 샘플에 레이블을 지정하고 적용을 클릭합니다. 실행을 클릭하여 접시를 읽습니다.
플레이트를 읽어야 하는 방향을 알리는 메시지가 표시되면 Run Options 화면에서 열 또는 행을 선택합니다. 개별 우물 또는 열 및 행 헤더를 두 번 클릭하여 각 샘플에 대해 허용되는 물방울 수를 결정하여 정보 테이블을 제공합니다. ddTRAP의 경우 10개, 000개 이상의 허용된 액적샘플이 추가 분석을 위해 유효합니다.
샘플 복제 및 NTC 샘플을 나타내는 우물을 강조 표시합니다. 화면 왼쪽 하단에 임계값을 설정하기 위한 아이콘을 클릭하여 샘플의 임계값을 수동으로 설정합니다. 이 프로토콜에서, 텔로머라아제 활성은 폐암과 텔로머라아제 음성 섬유아세포의 9개의 세포주로 구성된 세포 패널에서 측정되었다.
임계값은 SHP77, H2887 및 NTC에 대한 세 가지 생물학적 복제모두에 대해 약 2, 000형광 진폭으로 설정되었다. 양성 물방울은 6, 000 형광 진폭 주위의 형광 강도를 가지고 있었고, 이는 상단에 명확한 인구를 형성하고, 약 1, 100 형광 진폭주위의 부정적인 물방울에서 분리. 모든 샘플 간의 세포당 총 텔로머라제 연장 제품은 폐암 라인에서 텔로머라제 활성을 나타내는 핵산의 측정된 농도에서 추정되었다.
용해 또는 확장 반응 단계 중 모든 RNase 오염은 리보뉴클레오단백질 복합체이기 때문에 텔로머라아제 효소 활성을 파괴합니다. ddTRAP은 세포 내의 hTERT mRNA 발현 수준에서 ddPCR을 후속할 수 있다. 두 데이터 세트를 통해 hTERT 의 발현과 텔로머라제 활동과 상관 관계를 맺고 대체 접합과 같은 잠재적인 텔로머라제 규제 메커니즘을 자세히 파고들 수 있습니다.
우리는 특정 접합 요인과 텔로머라아제 활동에 미치는 영향에 대한 조작을 탐구 할 수 있습니다. 현재, 우리는 텔로머라아제 활성을 표적으로 하는 잠재적인 약으로 올리고뉴클레오티드 접합 변조기를 설계하고 있습니다.
