이 절차의 전반적인 목표는 성적 증명서 분석을 위한 세균성 복구 및 정제에 선행된 더 낮은 호흡기로 세균 접종의 간단하고 비침습적인 경로를 제공함으로써 이차 세균성 폐렴 연구를 강화하는 것입니다. 이것은 먼저 마우스를 심층적으로 마취하고 상악 절개에서 수직으로 중단 된 마우스의 기관에 미리 로드 된 무딘 팁 구부러진 바늘을 삽입하여 달성 될 것이다. 둘째, 성공적인 감염에 이어 세균성 식민지 형성 단위는 폐의 절제 및 균질화에 의해 회복됩니다.
그 결과 폐 균모제는 연속적으로 희석되고 영양 천에 도금되어 식민지 형성 단위를 열거합니다. 마지막으로, RNA는 폐 균질화로부터 정제된다. 이 절차의 장점은 하부 호흡기로 직접 제어 전달을 가능하게한다는 것입니다.
이를 통해 병원균의 조합적 및 개별 적인 기여를 질병의 결과로 볼 수 있습니다. 이 분야 내의 최근 발전은 세균성 유전자 조절이 감염의 결과를 결정하는 데 큰 역할을 할 수 있음을 입증했습니다. 이 기술은 세균성 CfU와 RNA둘 다 복구하는 기능에서 유익합니다.
일단 RNA가 고립되면, 우리는 감염을 향한 특정 독성 유전자의 기여를 평가할 수 있습니다. 또한,이 기술은 비 수술에서 혜택을 누릴 수 있습니다. 이를 통해 이 절차 내에서 사용되는 모든 동물에 최소한의 스트레스를 가하고 즉각적인 회복을 할 수 있습니다.
이 절차는 모든 유형의 카누라, 가이드 와이어 또는 광섬유 케이블을 사용하지 않고 일반적인 실험실 장비를 사용하는 것이 이점을 누릴 수 있습니다. 이 기술에 새로운 개인 기관기관을 통해 실제 설치와 처음에 투쟁 수 있습니다. 이 기술이 개념화되면 뮤린 호스트 내에서 이차 세균 성 폐렴을 심문하는 간단하고 효과적인 절차가됩니다.
절차를 시작하기 전에, 다음과 같은 공급으로 작업 공간을 준비 : 삽관 플랫폼, 멸균 하나의 mL 주사기, 멸균 무딘 팁 집게, 멸균 21 게이지 무딘 팁 바늘, 주사기와 집게를 저장하는 두 개의 원추형 튜브. 바람직한 최종 농도가 50 마이크로리터 부피에서 얻어지되도록 병원체 접종을 준비하여 절차를 시작합니다. 다음으로, 멸균 장갑을 사용하여 약 35도 각도로 구부려 서 1 ~ 1.5 인치 21 게이지 무딘 팁 바늘을 준비합니다.
주사기에 바늘을 고정 한 후, 100 마이크로 리터 공기 쿠션을 그린 다음 전염제의 50 마이크로 리터를 그립니다. 100 마이크로리터 에어 쿠션은 주사기를 우울하게 되면 병원균 부하를 완전히 전달합니다. 로드된 바늘과 주사기를 지배적인 손으로 쉽게 접근할 수 있는 위치에 놓습니다.
마취 챔버에서 마우스를 제거하고 마취하고 상악 절개에서 삽관 플랫폼에 마우스를 일시 중단합니다. 무딘 팁 포셉을 사용하여 혀를 부드럽게 잡고 확장합니다. 포셉에서 혀를 엄지손가락으로 옮기고 엄지손가락으로 옮기고, 엄지손가락으로 옮기는 다.
지배적이지 않은 손에 혀를 들고 있고 미리 장전된 주사기를 집어 들수 있습니다. 바늘의 구부러진 끝을 몸에서 멀리 가리킵니다. 바늘을 구강에 삽입합니다.
혀의 기지에서 부드럽게 몸에서 바늘의 약간의 푸시를 일으키는 손목을 각도. 이 작용은 바늘이 식도가 아닌 기관으로 삽입될 수 있도록 합니다. 천천히 기관으로 바늘을 안내합니다.
바늘이 보컬 폴드를 통과할 때 종종 약간의 진드기가 느껴집니다. 바늘이 카리나와 마주치면서 약간의 저항이 느껴지을 때까지 바늘을 기관지 통과시다. 약간 카리나 위의 바늘을 중단상향 방향으로 바늘을 들어 올립니다.
이를 통해 기본 기관지로 배달할 수 있습니다. 주사기 플런저를 완전히 우울하게 하여 전염성 하중을 전달합니다. 기관지에서 바늘을 제거하고 폐기하십시오.
고무 대역을 우울하게 하여 삽관 플랫폼에서 마우스를 제거하지만 마우스를 똑바로 세워 유지합니다. 나레 위에 손가락을 직접 배치하여 비강 기도를 방해하십시오. 이 위치를 약 1분 동안 또는 여러 번의 심호흡이 관찰될 때까지 유지하십시오.
이 마지막 단계는 총 접종부피가 하부 호흡기로 전달되도록 합니다. 동물을 케이지로 돌려보내 마취에서 신속한 회복이 있는지 확인하십시오. 선택된 시점에서 감염된 폐는 이차 세균성 폐렴과 관련된 증가된 이환율에 대한 세균 기여를 정량화하고 평가하기 위해 절제될 수 있다.
다음 항목으로 작업 공간을 준비 : 스케일 및 멸균 계량 보트, 해부 플랫폼, 가위와 집게를 포함하는 해부 키트, 멸균 거즈. 이 시연을 위해 폐의 절제는 벤치 탑에서 수행됩니다. 그러나, 이 절차 전반에 걸쳐 멸균을 유지하기 위해 폐 절제는 라미나르 흐름 후드 내에서 수행되는 것이 좋습니다.
감염된 마우스를 CO2 또는 이와 유사한 IACUC 승인된 안락사 방법으로 안락사시화한다. 해부 플랫폼에 감염된 마우스를 배치하고 보호합니다. 작업 표면에서 멸균을 유지하기 위해 에탄올로 마우스를 스프레이합니다.
움빌리쿠스에서 시작하여 쌍을 이루는 포셉을 사용하여 피부를 들어 올리고 후두쪽으로 절개를 합니다. 초기 절개 의 양쪽에 피부를 잡고, 몸에서 피부를 당겨 조직 연결을 통해 잘라. 흉부 부위를 더 많이 드러내기 위해 피부 전반에 걸쳐 측면 컷을 만드는 것이 도움이 될 수 있습니다.
시포이드 공정의 기지에서 시작하여 다이어프램을 뚫으려는 의도로 작은 절개를 합니다. 이것은 폐를 철회하는 원인이 되는 흉부 구멍에 있는 압력의 증가 결과로 초래합니다. 폐가 철회되면 절개를 계속하여 다이어프램을 풀어보라고 합니다.
양쪽에 절개를 하여 갈비뼈를 제거합니다. 이것은 흉부 구멍과 폐를 드러내게 될 것입니다. 폐를 절제하려면 집게로 심장의 기저근을 잡고 위쪽으로 들어 올립니다.
가위를 폐 뒤에 놓고 심장을 위쪽으로 들어 올리는 동안 조직 연결을 통해 작은 절개를 하기 시작합니다. 폐가 절제되면 멸균 거즈에 놓고 폐에서 들어 올려 나머지 조직 연결을 절단하여 심장을 제거하십시오. 폐를 미리 타르가 있는 계량 보트로 옮기고 질량을 기록합니다.
폐의 무게를 측정한 후 폐를 멸균 인산염 버퍼링 식염수로 옮기고 일시적으로 얼음에 보관하십시오. 이제 폐가 절제되고 무게를 측정되었으므로 박테리아는 병인을 향한 자신의 역할을 결정하기 위해 회복 될 수 있습니다. 세균 회복에 대비하여 티슈 그라인더, 멸균 RNase-free PBS, 베타-메르카토에탄올로 보충된 완충RLT, 1.5mL RNase 프리 마이크로센티심분리기 튜브 등의 소모품이 필요합니다.
먼저 멸균 RNase가없는 PBS의 1 mL을 조직 분쇄기에 추가하여 시작합니다. 일단 채워지면, 얼음에 티슈 그라인더를 저장합니다. 다음으로, 감염된 폐에서 회수된 세균 부하를 정량화하기 위해 일련의 멸균 RNase 프리 시리얼 희석 튜브를 준비합니다.
준비된 조직 분쇄기로 폐를 옮기고 회전하는 동안 받침대를 눌러 조직을 철저히 균질화합니다. 제조된 직렬 희석 관의 첫 번째로 균질화된 샘플의 조직 분쇄기 및 알리쿼트 100 마이크로리터를 엽니다. 콜로니 형성 단위를 열거하기 위해 영양 천고에 샘플과 접시를 일렬로 희석시.
CfUs는 폐 조직의 밀리그램 당 mL 당 ML 또는 CfU당 CfUs로 기록될 수 있습니다. 100 마이크로리터 알리쿼트가 제거된 후, 분쇄 받침대와 원심분리기를 섭씨 4도에서 10분 동안 4, 000 rpm에서 교체하십시오. 원심분리가 완료되면 펠릿 샘플에서 상체를 제거합니다.
상체는 저장하고 나중에 추가 분석을 위해 영하 80도에서 저장할 수 있습니다. RLT 베타-메르카토에탄올의 700 마이크로리터에서 균질화된 조직 펠릿을 다시 중단하고 시료를 멸균 RNase-free 1.5 mL 원심분리기로 이송한다. 이 시점에서 샘플은 영하 80도에서 저장할 수 있습니다.
RNA는 1mm 실리카 구슬을 포함하는 2mL 마이크로센트심분리기 튜브에 샘플을 적재하고 초당 6미터에서 20초 동안 비드 비터를 통해 처리함으로써 RLT 폐 균질 슬러리로부터 정제될 수 있다. RNA는 Voyich, 외에서 보고된 RNeasy 방법의 적응을 사용하여 즉시 정제된다. 분자 생물학에 있는 방법"2008, 이 비디오를 동반하는 원고에 기술되었습니다.
정제후, RNA 수율은 분광계계를 사용하여 정량화될 수 있다. 일단 정량화되면, 마이크로리터 당 50 나노그램의 여러 알리쿼트로 생성된 RNA를 희석하는 것이 유익하다. 이를 통해 샘플의 RNA는 여러 동결 해동 주기를 받지 않고 여러 분석을 위해 사용될 수 있습니다.
이 기술을 사용하면 제어된 병원균 하중을 하부 호흡기에 직접 설치할 수 있습니다. 이 배달 시스템의 효율성은 1 % Coomassie 화려한 블루 솔루션의 설치를 통해 입증 할 수 있습니다. 위쪽 행은 대조군 역할을 하는 감염되지 않은 폐 쌍을 표시하고, 아래 줄은 내내 설치를 통해 1%Coomassie 화려한 파란색 염료의 50 마이크로리터를 받은 폐 쌍을 표시합니다.
이 염료의 사용은 장내 설치가 좌우 폐안팎으로 병원균 부하의 균일한 분포를 제공하는 방법을 보여줍니다. 일단 감염되면, 병원균 하중을 회수하고 폐 조직의 절제 및 균질화에 의해 사후 설치 후 다양한 시간 지점에서 분석될 수 있다. 이 회복 기술의 효율을 입증하기 위해 각각 3마리의 마우스를 포함하는 2개의 그룹은 황색포도상구균의 낮고 고용량으로 감염되었다.
세균성 입력은 CFO를 열거하기 위해 영양 천에 도금되었습니다. 장내 설치 후 1시간 후, 마우스는 안락사되었고, 폐는 조직 분쇄기에서 절제되고 균질화되었다. 균질화 된 조직은 CfU를 열거하기 위해 영양 천에 연일 희석되고 도금되었습니다.
균질화된 폐 조직으로부터 분리된 RNA는 역실체 PCR에 의해 검사될 수 있고 표적 유전자의 상대적 전사체 풍부를 정량화하는 데 사용된다. 최소한의 배경 DNA 오염을 보장하기 위해 역전사를 첨가하지 않고 PCR 반응을 qRT-PCR 반응과 함께 실행하는 것이 좋습니다. 세균 부하 이외에,이 기술은 바이러스 부하의 설치 및 격리로 확장 될 수있다.
폐 조직의 균질화에 따라 바이러스 RNA는 바이러스 유전자의 성적 증명서 풍부를 측정하거나 바이러스 정량화를 위한 표준 곡선을 구성하는 데 사용될 수 있다. 이 시스템의 사용은 이차 세균성 폐렴을 연구하기 위해 매우 효율적이고 재현 가능한 시스템을 제공합니다. 이 절차를 마스터하면 대규모 실험에서 이 절차를 사용할 수 있습니다.
마우스를 안락사시키기 위해 일괄 처리로 작업하면 마우스당 30초 이내에 장내 설치가 발생할 수 있습니다. 이 완료 후, 폐의 절제로 이동, 이것은 마우스 당 약 2 ~ 3 분 완료 될 수있다. 여기에서 논의된 방법은 이차 세균 감염의 맥락 안에 있었습니다 동안, 통제된 납품 및 접종의 복구가 필요한 어떤 절차든지쪽으로 확장될 수 있습니다.
여기에 설명된 방법 외에도, 이러한 절차는 폐의 절제 전에 기관지알갈라 라베이지를 첨가함으로써 보충될 수 있다. 이것은 수시로 병원체 하중의 감소 복구 귀착되는 동안, 사이토카인 분석, 젖산 탈수소 효소 활동 및 다른 세포 집단의 식별과 같은 데이터를 얻는에서 유익합니다. 질병 병원발생의 보다 완전한 이해를 얻으려면 질병에 호스트와 병원체 기여를 모두 심문하는 것이 중요해진다.
이 비디오의 목적은 뮤린 호스트 내에서 이차 세균성 폐렴을 탐구하기위한 간단하고 효율적인 방법을 제공하는 것이었습니다.
