이 프로토콜은 강력한 급성 폐 손상을 일으키는 재현 가능한 폐렴 모델을 제공합니다. 이 모델의 다른 장점은 마우스에서 전염성 ARDS 또는 급성 호흡 곤란 증후군을 재현하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 앞서 언급했듯이 이 모델은 급성 폐 손상의 초기 및 후기 단계를 평가하고 해결하기 위해 사망률과 손상 수준을 쉽게 적정할 수 있는 경우 재현성이 높으며, 이는 치료 전략을 평가하기 위한 플랫폼 역할을 합니다.
이 프로토콜은 폐 손상의 진단 또는 치료를 위한 새로운 접근 방식을 제공하지는 않지만 새로운 치료법을 테스트할 수 있는 신뢰할 수 있는 모델이며, 이는 면역학, 폐 질환 및 전염병과 관련된 분야에서 특히 유용합니다. 이 기술의 장점 중 하나는 재현성입니다. 그러나 이 기술을 처음 수행하는 사람들은 카테터를 기관 내로 삽입하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.
그렇기 때문에 이상적으로는 이 기술을 배우는 사람들이 안락사된 동물에서 연습을 시작해야 합니다. 먼저 가열된 셰이커나 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 10분 동안 혈액 한천 플레이트를 데웁니다. 냉동실에서 새로운 박테리아 스톡 바이알을 꺼내 바이알이 완전히 해동될 때까지 섭씨 37도의 수조에서 부드럽게 저어 해동합니다.
따뜻한 물로 O-링이나 캡을 만지지 마십시오. 플레이트의 박테리아 콜로니를 수동으로 계산하려면 1회 10-6회 희석을 수행하고 사전 가열된 혈액 한천 플레이트에 마지막 희석에서 200마이크로리터를 플레이트합니다. 섭씨 37도에서 밤새 접시를 배양합니다.
다음 날, 주어진 공식을 적용하여 새로운 박테리아 농도를 결정하십시오. 마취된 쥐를 깨끗하고 멸균된 표면에 놓습니다. 앞니에 마우스를 걸고 앞다리를 부드럽게 테이프로 붙입니다.
목 부위를 면도하고 클로르헥시딘과 70% 알코올로 해당 부위를 소독합니다. 그런 다음 수술용 가위를 사용하여 1cm의 표재성 정중선 목을 절개하여 기관을 시각화합니다. 지방 조직이 많이 보이면 지방 조직을 세로로 조심스럽게 절개하여 기관을 시각화합니다.
혀를 바깥쪽으로 부드럽게 당기고 입을 통해 20게이지 혈관 카테터를 도입하여 카테터를 기관 안으로 전진시킵니다. 삽관을 용이하게 하기 위해 기관에 부드러운 압력을 가합니다. 삽관 후 마우스를 인공호흡기에 연결하여 삽관을 확인합니다.
인공호흡기 매개변수를 200마이크로리터의 일회 호흡량과 분당 200스트로크로 설정합니다. 삽관을 확인한 후 인공호흡기에서 마우스를 분리하고 200마이크로리터의 피펫, 겔 로딩 팁을 사용하여 혈관 카테터를 통해 50마이크로리터의 세균성 제제를 조심스럽게 주입합니다. 설치 후 마우스를 호흡기에 다시 연결하여 호흡을 다시 시작하십시오.
호흡기를 30-60초 동안 호흡보호구에 올려 놓고 호흡을 모니터링합니다. 느린 호흡 패턴이 관찰되면 마우스를 호흡기에 다시 연결하십시오. 피부에 접착제 한 방울을 떨어뜨려 절개 부위를 봉합합니다.
피부 주름을 모으고 접착제가 마를 때까지 부드러운 압력을 가합니다. 안락사된 쥐를 깨끗한 수술 보드에 누워서 앞니에 매달아 놓습니다. 쥐 피부에 70% 에탄올을 분사한 후 가위를 사용하여 기관을 시각화하기 위해 작고 표층적인 정중선 목 절제술을 만듭니다.
20게이지 카테터로 기관을 캐뉼레이팅하고 1밀리리터 주사기를 사용하여 1밀리리터의 칼슘이 없는 PBS를 기관 내에 조심스럽게 추가합니다. 폐를 완전히 확장한 다음 동일한 주사기를 사용하여 액체를 흡인합니다. 총 2밀리리터에 대해 절차를 두 번 반복합니다.
기관지 폐포 세척제(BAL)를 2밀리리터 분취액으로 옮깁니다. 가위를 사용하여 흉강을 열어 폐, 심장 및 기관을 노출시킵니다. 횡격막을 조심스럽게 절개하고 흉곽을 제거하여 폐 조직이 끼지 않도록 합니다.
복부 대동맥을 경절하여 출혈을 허용합니다. 가위를 사용하여 우심실을 약 1-2mm의 작은 절개로 폐 조직을 관류하고 20게이지 카테터를 사용하여 5ml의 차가운 PBS를 주입합니다. 관류에 성공하면 폐 조직이 하얗고 창백하게 변하고 PBS는 복부 대동맥을 통해 혈관 내 구획을 떠납니다.
그런 다음 조심스럽게 폐를 추출하고 기관에서 절개합니다. 또는 폐를 조직학에 사용하는 경우 20게이지 카테터를 조심스럽게 삽입하여 포르말린 용액으로 폐를 최대 25cm까지 팽창시킵니다. 폐가 막히면 기관 아래에 약 5cm 길이의 3/O 봉합 줄을 통과시키고 포르말린이 폐 조직에 머물도록 두 번 단단히 묶습니다.
나머지 조직에서 폐를 부드럽게 절개하고 10ml의 포르말린 용액이 들어 있는 15ml의 원뿔형 튜브에 넣습니다. BAL을 섭씨 4도에서 500G로 5분 동안 원심분리하고 별도의 튜브에서 무세포 상층액을 제거합니다. 100 마이크로리터의 용해 완충액을 1분 동안 첨가하여 적혈구를 용해시킵니다.
PBS 1밀리리터를 첨가하여 용해 반응을 중화합니다. BAL을 원심분리하고, 펠릿을 100 내지 300 마이크로리터의 PBS에 다시 부유시키기 전에 상층액을 제거한다. 다음으로, 자동 세포 계수로 0.4%trypan blue 염색으로 세포 계수를 수행합니다.
5 밀리리터의 차가운 PBS가 들어있는 15 밀리리터의 원뿔형 튜브에서 조직에서 폐를 부드럽게 절개합니다. 해부 후 PBS에서 폐를 제거하고 종이 타월로 말리십시오. 기관과 같이 적출된 다른 조직에서 오른쪽 및 왼쪽 폐를 절개합니다.
텍스트 원고에 설명된 대로 소화 칵테일을 준비하고 폐를 1밀리리터의 소화 칵테일이 들어 있는 C-튜브로 옮깁니다. 튜브를 조직 해리기로 옮기고 폐 조직 처리를 위한 표준화된 프로토콜을 따릅니다. 해리 후 10ml의 차가운 PBS를 튜브에 넣고 적절하게 혼합합니다.
얼음 위의 50밀리리터 원추형 튜브 위에 70미크론 셀 스트레이너를 사용하여 단일 셀 현탁액을 여과합니다. 현탁액을 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 실온에서 1분 동안 용해 완충액 1mm를 추가합니다.
그런 다음 10ml의 차가운 PBS를 첨가하여 용해 반응을 중지하고 상층액을 제거합니다. PBS에서 세포를 다시 현탁시키고 자동화된 세포 계수를 통해 트리판 블루 염색으로 세포 계수를 수행합니다. 생쥐에서 세균성 폐렴으로 인한 폐 손상 후, 감염된 그룹은 감염되지 않은 대조군에 비해 더 낮은 체중을 보였다.
폐렴 연쇄상 구균 (Streptococcus pneumoniae) 또는 Spn 그룹은 체중을 기준선까지 회복 한 반면, Klebsiella pneumoniae 또는 Kpn에 감염된 마우스는 감염 후 6 일 후 느린 회복을 보였습니다. BAL 단백질 농도와 BAL과 폐 모두의 총 세포 수는 감염된 그룹에서 현저하게 높았다. 두 모델 모두에서 염증 과정을 보여주는 대표적인 조직학적 절편은 접종 후 2일째, 4일째 및 6일째에 얻어졌으며, 심지어 10일째에도 Kpn에 감염된 마우스에서 지속적인 폐포 염증의 증거를 보여주었습니다.
Kpn에 감염된 마우스는 10일째까지 손상을 계속한 반면, Spn에 감염된 마우스는 6일째까지 폐 염증을 해결했다. Spn 감염 6일 후 다색 유세포 분석에 의한 면역 세포 풍경은 자연 살해 세포를 포함한 과립구, 간질 대식세포, 단핵구, B 세포 및 T 세포의 수가 증가한 것으로 나타났습니다. 이 방법을 시도하는 동안 카테터를 삽입하는 것이 복제 가능한 감염을 일으키는 열쇠입니다.
이는 급성 폐 손상 연구 및 해결을 위한 표적 식별을 위한 플랫폼 역할을 하는 신뢰할 수 있는 방법입니다.
