실험실에서 연구 SH에 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) 및 교육과 연구의 연방 교육부 (BMBF) 의료 감염 유전체학 (FKZ 0315828A)에서 교부금에 의해 지원되었다.

여기에 설명 된 동물 감염 실험 지침과 척추 동물의 사용에 대한 규제 지역 및 국제 (실험 동물 과학 협회 (FELASA)의 연맹의 예를 들면 유럽의 건강 법률)에 따라 설치를 수행해야합니다. 실험은 지역 윤리적 보드 및 기관 동물 관리위원회의 승인을 받아야합니다. S. 모든 실험 실험실이나 동물의 감염 폐렴은 클래스 II 바이오 안전성 내각에서 실시하고 있습니다. 1. 생물 발광 Pneumocococi의 감염성 주식의 준비 <ol><li> 80 ° C에서 (w / v)의 효모 추출물 및 유지 보수 20 % 글리세롤의 최종 농도 1 %로 보충 토드 휴이트 국물 재고의 폐렴 구균 문화를 준비 </li><li> 혈액 한천 플레이트에 깊은 냉동 재고 폐렴 구균 문화 소량의 플레이트와 5 % CO 2에서 37 ° C에서 10 시간 동안 박테리아를 배양한다. 티그는 혈액 한천 플레이트는 게놈에 luxABCDE 유전자 카세트의 트랜스포존 삽입 카나마이신 (150 ㎍ / ㎖)로 적절한 항생제가 포함되어 있습니다. </li><li> 10 시간의 최대 새로운 혈액 한천 접시에 신선한 식민지를 하위 재배하고 있습니다. </li><li> THY 매체는 10 % (V / V) 열 (56 ° C에서 30 분)를 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS) 폐렴 구균과 함께 보충 및 OD 0.05 ~ 600의 문화를 시작 접종한다. </li><li> 문화 OD 0.35-0.40 600에 도달 할 때까지 37 ° C에서 교반 및 5 % CO 2없이 폐렴 구균을 배양한다. 성장은 3 ~ 4 시간 정도 소요됩니다. </li><li> 10 분 동안 3,750 XG에 0.5 %의 FBS와 보충 인산염 완충 생리 식염수의 pH 7.4 (PBS)에서 발광 생물 폐렴 구균을 재현 탁 원심 분리하여 수확 폐렴 구균. </li><li> PBS/10 %의 FBS에서 원하는 농도로 접종을 조정합니다. 감염 량은 사용 된 폐렴 구균 균주와 마이크의 유전 적 배경에 따라 달라집니다전자. S.과 비강 비근 교계 CD-1 마우스를 감염 폐렴 D39 감염 량은 90 단위의 히알루로 보충 20 μL의 현탁액에 1 × 10 7 CFU로 조정해야 럭스. 이 자기 ​​분해를 트리거 때문에, 흔들거나 소용돌이 폐렴 구균하지 마십시오. </li><li> 5 % CO 2에서 37 ° C에서 하룻밤 성장 후 혈액 한천과 식민지의 열거에 10 배 희석으로 도금하여 접종 농도를 확인합니다. </li><li> 광학 영상 시스템을 이용하여 생물 발광을 측정함으로써 폐렴 구균 균액의 생물 발광을 확인한다. </li></ol> 2. 생물 발광 폐렴 구균과 비강​​ 및 마우스의 복강 내 감염 <ol><li> 급성 폐렴과 패혈증 모델 7 ~ 10 주 시대에 여성 비근 교계 마우스를 사용합니다. 이 마우스의 무게 20 ~ 30 g 인이어야한다. </li><li> 케타민 (ketamine)과 자일 라진의 복강 내 주사로 쥐를 마취. 혼합물 1.0 밀리그램을 준비100 ㎕의 멸균 0.9 %에서 케타민과 0.1 밀리그램 자일 라진 20g의 체중을 가진 마우스에 대한 (w / v)의 염화나트륨. 이것은 케타민위한 / kg 체중 50 MG 및 자일 라진 대해 5 ㎎ / kg 체중의 투여 량과 일치한다. 정확한, 마취제의 주입하기 전에 마우스의 무게를. </li><li> 복막 캐비티에 혼합물을 주입하고 마취제 행동과 동물이 narcotized 때까지 다시 케이지에 동물을 배치합니다. 마우스의 호흡이 매우 느리고 일정한 될 것입니다. 마우스는 세균 현탁액의 비강 접종 및 흡입은, 따라서 접종의 손실을 재채기가 발생하지 않도록, 완전히 narcotized해야합니다. 이것은 그들의 꼬리의 끝에서 마우스를 곤란하게하여 평가 될 수 있으며, 완전히 narcotized 마우스 응답이 결여된다. </li><li> 부드럽게 narcotized 마우스를 들고 똑바로 코 (그림 1)과 함께 손가락과 엄지 손가락 사이에 마우스를 누르고 있습니다. </li><li> 좁고 긴 팁 (젤 로더와 피펫을 사용하여팁) 마우스 26-29의 콧 구멍 (10 μL / 콧 구멍)에 여러 개의 작은 물방울 생물 발광 폐렴 구균 놓습니다. 마우스는 무의식적으로 박테리아를 흡입합니다. 똑바로 마우스 1-2 분을 잡고 마우스가 재채기 또는 접종을 유지할지 여부를 관찰합니다. </li><li> 실시간으로 감염을 모니터링하기 위해, 각각 변형 D39과 TIGR4, 1 × 10 7 7.5 × 10 7 폐렴 구균의 감염 량과 비강 7-10주 된 CD-1 마우스를 감염. 숙주 조직에 의한 흡수는없는 시스템에 대한 검출 한계가 약 1 × 106 생물 발광 박테리아이다. </li><li> 복강 쥐를 감염 (IP)을 평가하고 패혈증 마우스 감염 모델에서 폐렴 구균의 바이오 이미지 독성합니다. 변형 D39의 100 μL에 5 × 10 3 CFU를 사용하여 변형 TIGR4의 1 × 10 4. IP 경로를 사용하는 경우 마우스를 마취하지 않습니다. </li><li> PBS로 제어 마우스를 접종. <img alt="그림 1" fo:conteNT-폭 FO = &quot;5 인치&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1.jpg&quot;폭 = &quot;는 500px&quot;/&gt; 그림 1. S.와 CD-1 마우스의 비강 감염 폐렴. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . </li></ol> 3. 이미징 시스템을 사용하여 폐 및 혈액에 폐렴 구균 전파를 시각화 생체 내 이미징 시스템을 이용하여 실시간으로 비근 교계 CD1 암컷 마우스의 비강 감염 후 폐렴 구균의 콘텐츠 보급. <ol><li> 영상 시스템에 전환하고 preconfigurated 컴퓨터에있는 이미지 분석 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 촬상 시스템은 자동으로 초기화하고 CCD 카메라는 열전 활성화되기 전에 90 ° C로 냉각된다. </li><li> 설정 및 비닝 측정 마우스의 수에 의존동시에 생물 발광 신호의 강도에. 동물의 생물 발광을 모니터하는 뷰 (FOV)의 필드는 가변이며, 배율은 가슴 같은 동물의 단일 마우스 또는 부위를 측정하기 위하여 오 생쥐를 측정하기 22.5 cm의 FOV 사이의 범위, 및 3.9 cm의 FOV 또는 머리. </li><li> 정기적으로 1 분, 비닝 (binning)의 중간 정도, 22.5 cm의 FOV (세트 D)의 노출 시간을 사용합니다. 첫째, 발광 촬상 모드를 선택하고 촬상 파라미터를 설정. </li><li> 신호의 방출은 박테리아 균주 및 사용 마우스 균주, 및 마우스의 안료에 의존 할 수있다. 예를 들어, C57BL / 6 마우스를 사용하는 경우이 마우스 폐렴의 발전을 이미징 할 때 유용 할 수있는 생쥐의 가슴을 면도. </li><li> 이미지 prechosen 시간 간격으로 쥐를 감염. 최대 8 ~ 12 시간의 시간 간격으로 급성 폐렴 모델 마우스의 생물 발광을 측정합니다. observi에 의해 감염된 마우스의 복지를 모니터링자신의 외모, 행​​동, 체중의 손실의 결정을 겨. </li><li> 이전 챔버의 측정에 영상 장비의 마취 시스템의 마약 챔버에 마우스를 마취. 이소 플루 란과 산소의 혼합물의 흡입을 시작하고 마우스는 천천히 규칙적으로 숨을 쉴 때까지 기다립니다. </li><li> 시스템의 이미징 챔버로 마취 동물을 놓고 누운 위치에 마우스를 유지. 실 것입니다 다음 이미지 쥐의기도의 상단에 CCD 카메라. </li><li> 마취제를 흡입 할 수 있도록 관에에 자신의 코를 가진 동물을 놓습니다. </li><li> 가스 튜브를 통해 촬상 챔버로 이소 플루 란 마취 엔트리를 유지하도록 허용된다. </li><li> 챔버의 상단에 CCD 카메라를 활성화하려면 및 이미징 소프트웨어의 생물 발광 광학 영상을 눌러 &quot;획득&quot;을 시작합니다. 즉시 폐쇄 챔버에 쥐의 사진이 화면에 나타납니다. 1 분 후<html> 생물 발광 데이터의 오버레이를 측량하고 사진이 도시되어있다. </li><li> 이미지 오버레이 소프트웨어의 창에 표시 한 후 마취를 중지하고 다시 자신의 새장에 쥐를 넣어. </li><li> 마우스 복구를 위해 모니터링된다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2.jpg" width="500px" /> 그림 2. 마취 배양 챔버에서 마취 배양 챔버와.) IVIS 스펙트럼 이미징 시스템. B) IVIS 마취 시스템. C) 마우스 각각 IVIS 마취 및 IVIS 스펙트럼 시스템을 사용하여 발광 생물 폐렴 구균에 감염된 생쥐의 모니터링 자신의 코가 마취제를 흡입과 IVIS 스펙트럼 이미징 챔버 내에 위치. D) 마우스._blank &quot;&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. </li></ol> 4. 생물 발광 S.에 감염 마우스의 생물 발광의 정량화 및 평가 폐렴 <ol><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 전체 광자 (포톤 / 초)를 정량화하여 마우스 또는 마우스의 선택된 영역의 생물 발광 강도를 결정한다. </li><li> 그래프를 준비하는 Excel 데이터 시트에서 제공하는 광자 방출의 값을 사용합니다. 데이터 변이는 종종 그룹화 생쥐 내의 높기 때문에, 상이한 폐렴 구균 균주로 감염된 마우스에서의 차이를 표시하는 박스 휘스커 그래프를 생성한다. </li><li> 마우스 당 광자 또는 선택 영역의 복사 휘도의 평균 (광자 / 초 / cm 2 / SR)와 같은 대안 적 결과를 제공합니다. </li><li> 포톤 모드 ROI (관심 영역)의 측정 데이터를 정량적으로 제공된 다른 생체 내 이미징 시스템에 걸쳐 다른 비교 될 수있다생기 단위로 측정이 자동으로 계정에 카메라 설정을 (예 : 통합 시간, 비닝 (binning), F / 중지하고, 시야) 가지고 있기 때문에 RA 설정. </li></ol>

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Immunol. 178, 5848-5858 (2007).</li><li>Voss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choline-binding+protein+PspC+of+Streptococcus+pneumoniae+interacts+with+the+C-terminal+heparin-binding+domain+of+vitronectin.">The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin.</a> J. Biol. Chem. , (2013).</li><li>Cartwright, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumococcal+disease+in+western+Europe:+burden+of+disease,+antibiotic+resistance+and+management.">Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management.</a> Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).</li><li>vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+pneumococcal+isolates+from+pets+and+laboratory+animals.">Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Brehm, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+the+adenine+methylase+gene+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+pAM+beta+1.">Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1.</a> Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

<html> 동물에서 실시한 모든 실험은 지역 당국과 윤리위원회의 승인을 받아야합니다. 생체 내 감염 실험에서 감염된 동물의 다양한 호스트 틈새에 세균 ​​부하는 다양한 시점 후 감염에서 결정되어야한다. 이러한 실험 조건 하에서 동물은 종래의 혈액, 인두, bronchoalvelar 세척, 또는 폐, 비장, 뇌 등의 장기에서 박테리아의 분리에 희생되어야한다. 호스트 틈새 당 세균 수를 계산하고 병원성...

바이러스 나 세균에 의한 호흡기 감염은 전세계의 모든 사망의 약 삼분의 원인이 전 세계적으로 가장 일반적인 지역 사회 획득 임상 문제 중 하나가 남아있다. 키 세균 종은 헤 모필 러스 인플루엔자 및 폐렴 구균이 있습니다. 그러나 이러한 세균 종은 일반적으로 자연 호흡기 식물의 일반적인 성분이다. 따라서 세균 마차 침략 질환과 면역 상태 나 개인의 성향에 따라에 대한 특정 위험에 있습니다. 증상이 식민지는 침략적인 감염에 트리거됩니다. 폐렴 구균은 지역 사회 획득 폐렴 (CAP)과 인간의 균혈증의 가장 흔한 원인 중 하나의 주요 원인균이다. 건강한 사람의 S. 폐렴 (폐렴 구균)는 종종 그들이 비병원성 박테리아에 직면 상부 호흡기의 증상 및 무해 식민지 개척자이다뿐만 아니라, 헤 모필 러스 종으로 병원균 상주 식물의. 또는 포도상 구균 및 인간의 면역 방어 체계의 첫번째 줄. 운송 요금은 어린이에서 가장 높은 (37 %)과 3-5 (58 %) 붐비는 보육 시설 내에서 더 높은. 젊은 인구와 노인, 사업자 및 비 인두 분비물 6에서 에어로졸 전송을 통해 폐렴을 받고, 폐렴 구균 결합되는 백신 (성인 어린이와 23 가의 다당류 PPSV23에서 PCV10이나 PCV13) 중 하나를 사용하여 위험이 높은 그룹과 예방 접종에 속하지 미국 (미국)과 많은 유럽 국가 4 추천합니다. PCVs 어린이에서 가장 널리 혈청 형을 포함하는 동안 PPSV23는, 성인에 따라서 효율적으로 침습성 폐렴 구균 질환 (IPD)을 방지하는 미국과 유럽의 bacteremic 폐렴 구균 질환의 90 % ~에 대한 책임 혈청 형을 포함한다. 결과적으로, IPD 인해 백신 유형 (VT)에 redu은높은 독성의 가능성과 항생제 내성을 표시 CED하지만 nonvaccine 혈청 형은 4,7-12을 등장했습니다. 저수지 인두 유해 지역 감염을 시작하는 부비동 또는 중간 귀를 확산 폐렴 구균의 출발점입니다. 생명을 위협하는 CAP 4,13의 결과로 기관지 및 폐에기도를 통해 직접 전파 더 중요한 것은, 폐렴 구균. 폐 감염은 종종 이렇게 혈액으로 확산 병원체를 활성화하고 IPD의 원인, 조직과 장벽의 파괴와 함께 제공됩니다. CAP 및 IPD의 발생 빈도는 면역 사람의 나이 4,13의 극단에서 가장 높다. 높은 독성을 가진 병원체에 공생의 변환을 담당하는 상황이 논쟁에서 아직도있다. 그러나, 높은 독성 항생제 저항의 증가와 함께 동반 호스트 감수성과 진화 적응의 변화 외에 PNE에 중요한 영향을 미칠 것으로 제안되었다umococcal 감염 14-16. 병원체는 상피 세포 점막 친밀한 접촉을 매개 adhesins의 다양성을 부여한다. 기도 점액을 극복 한 후, 세포를 호스팅하는 폐렴 구균 준수는 세포 수용체와 표면에 노출 된 adhesins의 직접적인 상호 작용을 통해 분자에게 4,17,18 가교로서 세포 외 기질의 구성 요소 또는 혈청 단백질을 이용하여 용이하게된다. 등의 다양한 병원체 폐렴 구균은 숙주 면역 방어 메커니즘의 회피에 관련된 요소를 갖추고 있습니다. 또한, 그들은 이러한 각각 폐, 혈액 및 뇌척수액 (CSF), 5,17,19,20와 같은 다양한 호스트 milieus에 적응하는 능력이있다. 발병 기전과 염증 호스트 반응에 세균 요인의 영향은 폐렴, 균혈증의 실험 동물 모델에서 조사, 또는 21-25 뇌막염됩니다. 인간의 병원체에도 불구하고,이 모델은 우리입니다폐렴 구균 조직의 굴곡 운동, 독성 메커니즘, 또는 폐렴 구균 백신 후보의 보호도를 해독 LL 설립. 근친 마우스 종자의 유전 적 배경은 폐렴 구균에 감수성을 결정한다. CBA / CA와 SJL 생쥐는 폐렴 구균 감염 (22)에 대해 더 민감 동안 비강 폐렴 구균에 감염된 BALB / c 마우스는, 저항하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 인간 유전 배경 및 숙주 방어 메카니즘과 유사한이 감염의 결과를 결정한다는 것을 의미한다. 따라서, 더 노력이 폐렴 구균 감염에 덜 민감 쥐의 게놈에 저항 궤적을 해명 할 필요합니다. 연구 결과는 생체 내 독성 프로토콜의 변화를 이끌고있다. 대신 종종 과거에 사용 근친 BALB / c 마우스의, 매우 민감 CD-1/MF1 비근 교계 마우스 종자는 요즘 종종 기능 상실 폐렴 구균 독성의 적합성에 26-28 요인의 효과를 연구하는 데 사용됩니다. 또한, 가용성생물 발광 폐렴 구균 및 광학 이미징 기술의 감염의 실시간 생물 발광 및 bioimaging는 허용한다. 폐렴 구균에 최적화 luxABCDE 유전자 카세트 (플라스미드 폴-A 테네시 luxABCDE 4001 km의 R)는 트랜스포존 돌연변이 유발에 의한 염색체의 단일 통합 부위에 삽입되었다. 생물 발광 폐렴 구균은 독성의 적합성 요인과 다른 26,28-31 한 해부 사이트에서 자신의 전위 결핍 된 폐렴 구균 돌연변이 체의 감쇠를 평가하기 위해 사용되었다. 여기에서 우리는 쥐의 폐렴이나 패혈증 모델에서 폐렴 구균 감염의 및 bioimaging위한 프로토콜을 제공합니다. 비강 내 또는 복강 내 감염 생쥐의 증폭 및 생물 발광 폐렴 구균의 보급이 용이하게 상이한 시점에서 광학 이미징 시스템과 같은 동물을 사용하여 시간에 걸쳐 모니터링 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="985">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Todd Hewitt broth</td>
			<td style="width:280px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">X936.1</td>
			<td style="width:280px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:280px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">2363.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Blood agar plates</td>
			<td style="width:280px;">Oxoid, Wesel, Germany</td>
			<td style="width:129px;">PB5039A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:280px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">T832.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:280px;">Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:129px;">E6376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:280px;">PAA Laboratories, Coelbe, Germany</td>
			<td style="width:129px;">A11-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">CD-1 mice, female</td>
			<td style="width:280px;">Charles River, Sulzfeld, Germany</td>
			<td style="width:129px;">CD1SIFE06W08W</td>
			<td>female CD-1 mice, six to eight weeks old</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamin 500mg, Curamed injection solution</td>
			<td>Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Rompun 2%, injection solution</td>
			<td>Bayer Animal Health, Monheim, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Plastipak 1 ml syringes</td>
			<td>Becton Dickinson, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:129px;">300015</td>
			<td>sterile Luer-Lok&#8482; syringes with needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Gel Loader Tips</td>
			<td style="width:280px;">peqlab</td>
			<td style="width:129px;">81-13790</td>
			<td>M&#181;ltiFlex&#8482; Tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Hyaluronidase</td>
			<td style="width:280px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">H3884-100mg</td>
			<td>Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Oxygen</td>
			<td style="width:280px;">Air Liquide, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td style="width:129px;">M1001L50R2A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Isofluoran</td>
			<td style="width:280px;">Baxter, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">pGEM-T Easy</td>
			<td style="width:280px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Oligonucleotides </td>
			<td style="width:280px;">Eurofins MWG, Ebersberg, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Qiaprep Spin Midiprep Kit </td>
			<td style="width:280px;">Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:129px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:296px;">PCR DNA purification kit</td>
			<td style="width:280px;">Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:129px;">28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:296px;">Equipment</td>
			<td style="width:280px;"> </td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Living Image 4.1 software</td>
			<td style="width:280px;">Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td style="width:280px;">Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">IVIS Spectrum Imaging System </td>
			<td style="width:280px;">Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Biophotometer</td>
			<td style="width:280px;">Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:129px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following in real time the impact of pneumococcal virulence factors in an acute mouse pneumonia model using bioluminescent bacteria

폐렴 개발의 주요 건강 문제와 선진국 중 하나이며 상당한 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 이 질병의 지식, 중환자 실 (ICU)의 가용성, 강력한 항균제하고 효과적인 백신의 사용의 발전에도 불구하고, 사망률은 1 높은 수준으로 유지. 폐렴 구균은 지역 사회 획득 폐렴의 주요 원인균 (CAP)입니다 인간의 균혈증의 가장 흔한 원인 중 하나. 이 병원체는 표면에 노출 된 adhesins 폐렴 및 침습성 폐렴 구균 질환 (IPD)에 기여 독성 요인의 armamentarium에 장착되어 있습니다. 세균의 적합성 또는 독성 인자의 생체 내 역할의 평가는 S.를 해결하는 것을 가장 중요합니다 폐렴 병원성 메커니즘. 폐렴, 균혈증 및 뇌막염 뮤린 모델 DIF에서 폐렴 구균 성 요인의 영향을 결정하기 위하여 사용되고감염의 단계를 ferent. 여기에서 우리는 비강 또는 생물 발광 박테리아와 복강 내 감염 후 마우스에서 실시간으로 폐렴 구균 보급에 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다. 결과는 묘화 시스템 및 첨부 된 분석 소프트웨어를 사용하여 시각 및 평가 될 수 하부 호흡기 및 혈액에서 곱셈과 폐렴 구균의 확산을 보여준다.

메티오닌의 수집 및 흡수는 자신의 호스트의 틈새 (32, 33)의 체력을 유지하기 위해 폐렴 구균에 대한 중앙 중요하다. 메티오닌 ABC 수송 단백은 SPD _ 0151 유전자 (TIGR4 : sp_0149)에 의해 D39으로 인코딩되어 MetQ 32라는 이름의. 폐렴 구균은 또한 메티오닌 생합성 효소 (-; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, 벼 및 METF Spd_0511 Spd_0510 D39)를 생산하고 있습니다. 화학적 매체에있는 메티오닌?...

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Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

폐렴 구균은 중증 지역 사회 획득 폐렴과 전 세계적으로 2 백만 이상의 죽음에 책임을 일으키는 주요 병원균이다. 적합성 또는 병독성에서 내포 세균성 요인의 영향은 생물 발광 박테리아를 이용한 급성 마우스 폐렴이나 균​​혈증 모델에서 실시간으로 모니터링 할 수있다.

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

following-real-time-impact-pneumococcal-virulence-factors-an-acute

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.0K 조회수.  University of Greifswald.  폐렴 구균은 중증 지역 사회 획득 폐렴과 전 세계적으로 2 백만 이상의 죽음에 책임을 일으키는 주요 병원균이다. 적합성 또는 병독성에서 내포 세균성 요인의 영향은 생물 발광 박테리아를 이용한 급성 마우스 폐렴이나 균​​혈증 모델에서 실시간으로 모니터링 할 수있다. 

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Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

연구

면역학 및 감염병학

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사<em&gt; 체외</em&gt; 준수의 분석

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

의 캡슐 혈청 형<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; Quellung 반응을 이용하여

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

<em&gt; 생체 내</em&gt; 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human diseases have been reported to be associated with four species of bacteria: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, and Aeromonas caviae. The model organism Caenorhabditis elegans is a bacterivore that provides an excellent infection model by which to study the bacterial pathogenesis of Aeromonas. Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection using a C. elegans model, including survival, liquid toxicity, and muscle necrosis assays. The results of the three methods determining the virulence of Aeromonas were consistent. A. dhakensis was shown to be the most toxic among the 4 major Aeromonas species causing clinical infections. These methods are shown to be a convenient way to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species and contribute to our understanding of the pathogenesis of Aeromonas infection.

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection in C. elegans. Using these convenient methods, it is easy to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species.

꼬마 선 충 모델에서 Aeromonas 감염의 병 인 및 독성 평가

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

리스테리아 단세포 유전자 감염 다음 마우스 비장에서 시투 인터페론 감마 생산의 이미징

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

감염의 간단한 마우스 모델에서 녹농균 및 독성 감쇠에 대한 테스트에서 프레임 내 유전자 삭제 돌연변이의 생성

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

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사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae와 인플루엔자 바이러스