우리의 프로토콜은 피부 염증 중 염증 성 중재자와 신경 영양의 사이트 별 생산을 결정하기위한 사용하기 쉽고 저렴한 표피 - 진피 분리 기술입니다. 이 기술의 주요 장점은 진피로부터 표피의 효소 분리가 4°C에서 수행되어 mRNA 와 단백질의 무결성을 유지한다는 것입니다. 이 방법은 새로운 치료 내정간섭의 발달을 위한 급성 및 만성 염증 도중 1 차적인 발포성 단자 감속하는 중재자의 모형에 통찰력을 제공합니다.
상처 치유, 피부 질환, 만성 상처 및 화상은이 연구에서 유익할 수 있습니다. 그리고 이 방법은 기관 및 각막과 같은 다른 상피 표면에 적용될 수 있었다. 최적의 분리 시간은 실험실 간에 약간 다를 수 있습니다.
분리의 품질을 결정하기 위해 2D 형태 평가와 결합된 다른 시간 지점을 비교하는 예비 실험이 권장됩니다. 마취 된 8 ~ 9 주 된 스프라그 Dawley 쥐에서 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, PBS에서 희석 된 1X 람다 카라게난100 마이크로 리터로 오른쪽 글래브로우스 뒷발을 피하로 주입합니다. 캘리퍼를 사용하여 주사 후 6 시간 및 12 시간 후 뒷발 중족골 두께를 측정하여 자극에 대한 응답으로 부종의 부피를 결정합니다.
적절한 실험 적 끝점에서, 주입 된 발에서 글래브로스 뒷발 피부의 하나 2 밀리미터 조각을 수확하고 마이크로 디즈 섹션 집게를 사용하여 15 ~ 60 분 동안 얼음에 미세 원심 분리 튜브에서 차가운 DMEM의 1 밀리리터로 피부를 전송합니다. 조직이 배양하는 동안, 얼음에 24 웰 세포 배양 판의 10 우물에 갓 준비 된 활성 열분해신 의 1 밀리리터를 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 마이크로 절개 집게를 사용하여 1개의 피부 샘플을 용액에 침지하지 않고 활성화된 열량, 각막 면의 각 우물으로 옮기는 것입니다.
피부가 열립에 침지되지 않고 지층 각막이 효과적인 분리를 달성하기 위해 직면하는 것이 중요합니다. 2~3시간 후, 미세 절개 집게를 사용하여 페트리 접시에 섭씨 4도의 7~8밀리리터에 한 개의 피부 샘플을 담그어 표피가 진피에서 분리할 수 있는 더 많은 공간을 허용합니다. 시료의 경계에서 거의 반투명 표피가 관찰될 때까지 집게를 사용하여 피부 둘레의 표피를 부드럽게 브러시합니다.
표피가 진피에서 눈에 띄게 분리되면, 조심스럽게 한 쌍의 집게로 피부의 각 층을 잡고 천천히 진피에서 표피를 당긴 다음, 광적으로 일관적있는지 확인하기 위해 빛 현미경에 의해 격리 된 표피의 투명도를 평가합니다. 층이 제대로 분리된 경우 표피 및 진피 조직을 DMEM에 있는 5밀리미터 EDTA의 개별 용기에 30분 동안 섭씨 4도에 넣습니다. 열분해 후, 동요와 실온에서 1 시간 동안 적절한 고정에 표피의 일부를 수정합니다.
인큐베이션의 끝에서, 교반과 실온에서 1 시간 동안 PBS에 고정 된 조직을 배치, 단면에 적합한 조직 포함 매트릭스에 샘플을 동결하기 전에. 저온을 사용하여 14 마이크로미터 두께의 단면을 얻고 해동하여 젤라틴 코팅 유리 현미경 슬라이드에 섹션을 장착하십시오. 슬라이드 워머에서 건조한 후 90초 동안 toluidine blue의 작동 용액으로 샘플을 얼룩지게 합니다.
그 후, PBS로 슬라이드에서 톨루이딘 블루를 부드럽게 씻고 수성 장착 매체로 커버립을 반대한 다음 50~250X 배율로 브라이트필드 현미경으로 표피를 관찰합니다. 쥐 뒷발에 카라게난 주사는 염증의 고전적인 증상을 일으키는, 둘 다에 발적과 부종 등 6 그리고 12 시간 후 주입. 브라이트필드 현미경 검사는 쥐 글래브루스 뒷발 피부의 표피와 진피의 열량 분리의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있다.
실제로, 표피 단면의 토루이딘 블루 염색은 표피가 기준막의 진피로부터 분리되어 있지만, 표피 레테 능선과 진피 유두로부터의 들여쓰기가 그대로 유지된다는 것을 보여준다. 또한, 모든 각질 세포 층이 관찰된다. 열리 신 분리 표피의 서쪽 얼룩은 4 섭씨에서 기술 도중 안정적인 단백질 수준을 나타내는 일관된 결과를 생성합니다.
아주 작은 NGF 단백질은 순진한 쥐 표피에서 검출됩니다, 그러나 NGF 단백질 수준은 카라지난 유도한 염증의 6 시간 후에 현저하게 강화됩니다. 주입 후 12시간 후, NGF 수준은 6시간 동안 관찰된 수준에 비해 감소되지만 컨트롤에 비해 높은 수준을 유지합니다. 서양 블롯 분석에서 예상대로, NGF 면역 반응성은 순진한 대조표 조직 샘플에서 검출되지 않지만, 카라게난 유도 염증 후 6 시간 에서 NGF 면역 반응성은 지층 과립 및 지층 루시덤의 대부분의 각질 세포에서 관찰됩니다.
지층 스피노섬에 있는 몇몇 세포는 또한 NGF 면역반응성이다. 열리신을 사용하여 손상되지 않은 표피를 분리하는 경우 최적의 분리 시간이 최종 사용자가 경험적으로 결정해야한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 다양한 프로테오믹 및 분자 기술은 특정 단백질 및/또는 1차 유전자 전사체의 발현을 검증하여 이 절차가 기저 발현을 변경하지 않는다는 것을 확인하는 데 사용될 수 있다.
표피 진피 분리의이 기술은 연구원이 다른 피부 염증 모델에서 신경 trophins 및 선동적인 중재자의 사이트 특정 표현에 관하여 추가 질문에 대답할 수 있습니다. 피릭산과 파라포름알데히드는 위험합니다. 연기 후드에 두 화학 물질과 함께 작업, 개인 보호 복과 장갑을 사용하고 처리 후 얼굴과 손을 씻어.
