여기에서 입증 된 두 가지 필링 기술은 개별 막대 세포 하부 구획을 분리하고 건강하고 병든 막대의 각 특수 구획에서 발생하는 중요한 생리 학적 과정을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 마우스 망막에서 다른 막대 세포 구획을 분리하는 것은 어려울 수 있습니다. 이러한 간단한 기술은 저렴하고 평범한 실험실 재료를 사용하여 단백질 분석을 위해 막대 세포 하부 구획을 안정적으로 분리합니다.
시작하려면 100 % 산소로 버블 링된 Ames HEPES 버퍼로 채워진 페트리 접시에 여과지 조각을 넣으십시오. 그런 다음, 넓은 보어 전달 피펫을 사용하여, 두세 달 된 C57 Black 6J 마우스로부터 해부된 망막 사각형 하나를 옮긴다. 분할 된 망막을 오목하게 향하게하고 광수용체가 접시의 바닥을 향해 아래로 향하고 있는지 확인하십시오.
그런 다음 핀셋을 사용하여 반으로 줄어든 망막의 측면을 가볍게 잡고 여과지 위로 옮깁니다. 망막이 중앙에 배치되면 여과지를 위쪽으로 움직여 반으로 줄인 망막이 여과지에 닿아 막대 외부 세그먼트를 만들거나 ROS를 필터링하여 용지 접착을 만듭니다. 부착된 망막이 있는 여과지를 조심스럽게 Ames HEPES 버퍼에서 들어올립니다.
여과지의 아래쪽을 종이 타월에 놓고 두세 번 닦아 말립니다. 망막이있는 여과지 측면에 Ames HEPES 한 방울을 넣고 여과지를 종이 타월에 다시 올려 놓고 말리십시오. 그런 다음 망막이있는 여과지를 페트리 접시에 다시 넣고 핀셋을 사용하여 반으로 줄어든 망막의 모든 가장자리를 부드럽게 밀어 올리고 모든면의 여과지에서 멀리 떨어 뜨립니다.
망막을 여과지에서 섬세하게 벗겨 내고 망막의 극한 둘레만 만져서 구조적 완전성을 유지합니다. 그런 다음 페트리 접시에서 여과지를 들어 올리고 종이 타월에서 과도한 액체를 제거하여 망막과 접촉하는 쪽이 종이 타월에 닿지 않도록하십시오. 부분 ROS 층이 있는 여과지를 얼음 위에 라벨이 붙은 튜브에 넣고, 껍질을 벗긴 망막을 Ames HEPES 완충액에 잠기게 유지한다.
이 반으로 줄어든 망막에 대해 박리 과정을 대략 일곱 번에서 여덟 번 반복하여 전체 ROS 층을 제거한다. 각각의 껍질 후에, 여과지를 동일한 튜브에 넣어 하나의 반으로 줄어든 망막으로부터 분리된 모든 ROS를 결합시킨다. 즉시 사용할 수 있도록 분리된 ROS의 모든 여과지 껍질이 들어있는 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
핀셋을 사용하여 남은 껍질을 벗긴 망막을 적절하게 라벨이 붙은 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 보관하여 즉시 사용하십시오. 동결 건조를위한 망막 샘플을 준비하려면 여과지 조각을 놓고 반으로 줄어든 망막을 차가운 링거의 버퍼로 채워진 페트리 접시에 옮깁니다. 다음으로, 핀셋을 사용하여 망막을 조심스럽게 뒤집어 오목한 방향으로 향하게하고 여과지 위에 놓이도록 움직입니다.
절반으로 줄어든 망막 조각이 여과지에 닿도록 가장자리를 위쪽으로 들어 올립니다. 계속해서 Ringer의 솔루션에서 필터 페이퍼를 들어올립니다. 그런 다음 여과지의 바닥면을 종이 타월에 놓고 조심스럽게 두세 번 닦아 과도한 액체를 제거하십시오.
그런 다음 핀셋이있는 여과지를 집어 들고 망막이있는 여과지 측면에 차가운 링거 한 방울을 추가하십시오. 다시 한 번, 과도한 액체를 제거하기 위해 종이 타월에 여과지를 놓습니다. 부착 된 각 망막과 여과지 샘플을 모든 샘플을 동결 할 준비가 될 때까지 차가운 링거로 채워진 페트리 접시에 보관하십시오.
그런 다음 핀셋을 사용하여 각 샘플을 차가운 링거의 버퍼에서 들어 올려 핀셋이 여과지 가장자리에만 닿도록하여 반으로 줄어든 망막을 피하십시오. 각 여과지의 아래쪽을 종이 타월에 올려 놓고 과도한 액체를 제거하십시오. 그런 다음 망막이 부착 된 여과지 측면에 차가운 PBS 한 방울을 넣고 여과지를 종이 타월에 다시 닦으십시오.
모든 여과지 조각을 페트리 접시에 넣고 보풀이없는 티슈 페이퍼를 사용하여 여과지 주변의 과도한 액체를 제거합니다. 그런 다음 접시 전체를 알루미늄 호일로 단단히 감싸고 알루미늄 호일의 가장자리가 고정되어 페트리 접시의 바닥에 부드럽게 눌러지도록하십시오. 알루미늄 호일 뚜껑에 0.1 ~ 0.2 밀리미터 구멍 몇 개를 뚫습니다.
다음으로, 금속 집게를 사용하여 알루미늄 호일로 덮인 페트리 접시를 액체 질소로 서서히 내립니다. 동결건조할 준비가 될 때까지 샘플을 액체 질소에 보관하십시오. 동결 건조를 위해 알루미늄 호일로 덮인 페트리 접시를 동결 건조 플라스크에 넣고 제조업체의 프로토콜에 따라 동결 건조기 기계에 부착하십시오.
망막을 30 분 동안 동결 건조하십시오. 동결건조 후, 동결건조된 망막 위에 작은 테이프 조각을 조심스럽게 깔고 핀셋으로 약간의 압력을 가하여 광수용체 층과 결합하도록 하여 막대 외부 및 내부 세그먼트를 수집합니다. 테이프를 천천히 떼어내고 ROS와 RIS가 모두 테이프에 부착되었는지 확인합니다.
얇은 흰색 필름이 골절 된 표면에 나타납니다. 이것이 RIS입니다. 이 RIS를 분리하려면 다른 테이프 조각을 놓고 테이프를 파쇄된 표면에 아래로 밀어 넣습니다.
그런 다음 주황색 분홍색 층만 있는 테이프 조각을 ROS로 표시된 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 얇고 흰색 층이 있는 테이프 조각을 RIS라고 표시된 다른 튜브에 넣습니다. 다음으로, 테이프를 사용하여, 두껍고 하얀 층을 벗겨냄으로써 여과지 상에 위치된 남아있는 망막 조직을 수집한다. 그런 다음, 이것을 분리하여 OIS라고 표시된 튜브에 넣는다.
같은 날 사용하는 경우, 동결건조된 망막으로부터 분리된 층을 실온에서 저장한다. 암흑적응 동물에서, GNAT1 및 ARR1의 분포는 공지된 암흑 상태 분포와 밀접하게 일치하였으며, 여기서 GNAT1 신호는 ROS 분리에서 눈에 띄게 가장 강했고, ARR1 신호는 ROS 분리에서 더 강했다. GNAT1 및 ARR1 신호의 정량화는 ROS 및 ROS 샘플에서 GNAT1 및 ARR1에 대한 암흑도 조건 사이에 유의한 차이를 보였다.
어두운 샘플과 밝은 적응 샘플 모두에서 G beat 5S, 시토크롬 C 및 액틴 신호는 ROS 샘플에서 제외되어 다른 세포 층으로부터의 오염이 없음을 입증합니다. 추가적으로, G 베타 5L 신호는 ROS 샘플에서 명확하게 볼 수 있었다. 무손상되고 박리된 동결건조된 망막의 표면의 주사 전자 현미경 검사는, 접착 테이프로 박리하기 전에, 무손상 동결건조된 망막의 표면이 특징적인 원통형 ROS와 밀접하게 일치한다는 것을 보여주었다.
초기 테이프 박리 후, ROS 및 RIS는 남은 망막, 박리, 동결건조된 망막의 표면 상에 존재하는 균일한 핵층에 의해 입증된 바와 같이 완전히 제거되는 것으로 나타났다. 후속 테이프 박리는 박리된 층의 자유 표면으로부터 RIS를 제거하였다. 이 기술은 또한 GRK1 면역반응성이 광-노출된 망막에서 ROS 샘플에서 가장 강렬하고, OIS 샘플에는 부재한다는 것을 입증하였다.
반대로, ROS 및 RIS 샘플은 PKC 알파에 대해 희미한 신호를 표시했는데, 이는 일반적으로 면역형광 염색에 의해 ROS 또는 RIS에서 검출되지 않는다. 마지막으로, 차선책의 테이프 필링은 약간 오염 된 샘플을 생성 할 수 있습니다. RIS 샘플은 일부 OIS 샘플로 오염되어 G 베타 5L 및 G 베타 5S 대역 및 더 높은 PKC 알파 신호를 생성했습니다.
망막을 동결 건조 할 때는주의를 기울여야합니다. 부적절한 동결 건조 기술을 사용하면 망막이 녹아 테이프로 다른 막대 하부 세포 층을 분리하는 것이 불가능해질 수 있습니다. qRT-PCR과 함께 이러한 테이프 박리 방법을 사용하여 망막의 나머지 부분으로부터 광수용체 전사체의 분리를 허용하였다.
