ラット表皮と真皮をサーモリジンと分離して、部位特異的炎症性mRNAおよびタンパク質を検出する

我々のプロトコルは、皮膚炎症時の炎症性メディエーターおよびニューロトロフィンの部位特異的産生を決定するための使いやすく、安価な表皮皮膚分離技術である。この技術の主な利点は、真皮からの表皮の酵素分離が摂氏4度で行われ、mRNAとタンパク質の完全性を維持することです。この方法は、新たな治療介入の開発のための急性および慢性炎症の間に原発性の不感性末端を感作するメディエーターの種類に関する洞察を提供する。

創傷治癒、皮膚疾患、慢性創傷、および火傷は、この研究の恩恵を受ける可能性があります。そして、この方法は、GI管および角膜のような他の上皮表面に適用することができる。最適な分離時間は、ラボ間で若干異なる場合があります。

分離の質を決定するために、異なる時点を2D形態評価と組み合わせた予備的な実験をお勧めします。8~9週齢のスプレイグ・ドーリーラットの麻酔でペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、PBSで希釈した1Xラムダカラギーナンの100マイクロリットルで右グラブロス後足を皮下注射する。カリパーを使用して、注射の直前と6時間と12時間後に後足の中足骨の厚さを測定し、刺激に応答して浮腫の体積を決定します。

適切な実験エンドポイントでは、鋭いメスを使用して注入された足からグラブロス後足の皮膚を1ミリメートルずつ収穫し、マイクロディセクション鉗子を使用して氷上のマイクロ遠心チューブ内の冷たいDMEMの1ミリリットルに皮膚を15〜60分間移します。組織がインキュベートしている間に、氷の上の24ウェル細胞培養プレートの10個の井戸に作りたての活性化サーモリシンを1ミリリットル加えます。インキュベーションの最後に、マイクロ解離鉗子を使用して、溶液中にサンプルを浸すことなく、活性化サーモリシン、角層側の各ウェルに1つの皮膚サンプルを移管する。

皮膚がサーモリシンに浸からず、角層が直面して効果的な分離を達成することが重要です。2〜3時間後、マイクロ解剖鉗子を使用して、1つの皮膚サンプルをペトリ皿に7〜8ミリリットルの摂氏DMEMに浸し、表皮が真皮から分離する余地を増やします。鉗子を使用して、サンプルの境界で半透明の表皮が観察されるまで、皮膚の周囲の表皮を優しく磨きます。

表皮が真皮から著しく分離する場合、皮膚の各層を1組の鉗子で慎重に把握し、真皮から表皮をゆっくりと引っ張り出し、次に、光顕微鏡で単離された表皮の半透明を評価し、光学的に一貫していることを確認する。層が適切に分離されている場合は、表皮組織と真皮組織をDMEMの5ミリモルEDTAの個々の容器に30分間摂氏4度で配置します。サーモリシンが失活した後、攪拌で室温で1時間、表皮の一部を適切な固定剤で固定する。

インキュベーションの終わりに、固定組織をPBSに10%スクロースに入れ、攪拌で室温で1時間、切断に適した組織埋め込みマトリックスでサンプルを凍結する前に行う。クライオスタットを使用して厚さ14マイクロメートルの断面を得て、ゼラチンコーティングガラス顕微鏡スライドにセクションを解凍します。スライドウォーマーで乾燥した後、90秒間トルイジンブルーの作業溶液でサンプルを染色します。

その後、PBSでスライドからトルイジンブルーを静かに洗浄し、水性取り付け媒体でカバーリップに反対し、50〜250倍の倍率でブライトフィールド顕微鏡で表皮を観察します。ラット後足へのカラギーナン注射は、注射後6時間と12時間の両方で発赤や浮腫などの炎症の古典的な症状を引き起こす。ブライトフィールド顕微鏡は、ラットグラブロス後足の皮膚の表皮と真皮のサーリシン分離の有効性を評価するために使用することができる。

実際、表皮断面のトルイジンブルー染色は、表皮がベースライン膜の真皮から分離されているが、表皮レテ尾根および真皮乳頭からの痕直しがそのまま残っていることを示している。また、ケラチノサイト細胞層の全てが観察される。サーモリシン分離表皮のウェスタンブロッティングは一貫した結果を生じ、4°Cの技術の間に安定したタンパク質レベルを示す。

ナイーブラット表皮ではNGFタンパク質が検出されることはほとんどありませんが、6時間のカラギーナン誘発炎症の後、NGFタンパク質レベルは有意にアップレギュレートされます。注射の12時間後、NGFレベルは6時間で観察されたものに比べて低下するが、対照に対して上昇したままである。ウェスタンブロット分析から予想されるように、NGF免疫反応性は、ナイーブコントロール表皮組織サンプルでは検出されないが、カラギーナン誘発炎症後6時間で、NGF免疫反応性は、角層および角層の角質細胞のほとんどで観察される。

尖塔内の細胞もNGF免疫反応性である。サーモリシンを使用して無傷の表皮を分離する場合、最適な分離時間はエンドユーザーが経験的に決定しなければならないことを覚えておくことが重要です。様々なプロテオミクスおよび分子技術を用いて、特定のタンパク質および/または一次遺伝子の転写産物の発現を検証し、この手順が基礎的発現を変化させないことを確認することができる。

この表皮-真皮分離の技術は、研究者が異なる皮膚炎症性モデルにおける神経トロフィンおよび炎症性メディエーターの部位特異的発現に関する追加の質問に答えることを可能にする。ピク酸とパラホルムアルデヒドは危険です。ヒュームフードの両方の化学物質で作業し、個人的な防護服や手袋を使用し、取り扱い後に顔と手を洗います。