성인 얼룩말 물고기에 심장 연구에서, 약물 치료는 일반적으로 체계적인 방법으로 이루어집니다. 내트라토라시성 주사를 사용하면 심근 손상을 일으키지 않고 심장에 용액을 로컬로 제공할 수 있습니다. 이 방법은 성인 얼룩말 물고기의 심장 주위에 정확하게 해결책에 있는 약, 단백질, 또는 그밖 분자의 소량의 납품을 허용합니다.
이 절차를 시작하려면 바늘 풀러를 사용하여 미세 주입 조정 된 보로실리케이트 유리 모세 혈관을 당깁니다. 9센티미터 페트리 접시에 점토 또는 접착제 테이프를 모델링하는 레일에 당겨진 모세혈관을 보관합니다. 일반적인 가위를 사용하여 스폰지 조각을 자르고 중간에 생선 모양의 실루엣을 조각합니다.
다음으로, 테스트된 단백질 또는 기타 화합물로 주사 솔루션의 작은 알리쿼트(aliquots)를 준비한다. 10%페놀 레드로 보완된 1x Hanks의 균형 잡힌 소금 용액으로 물질을 희석하여 분석에 따라 집중력을 조절합니다. 마취제의 작동 농도를 얻으려면 100 밀리리터의 생선 물을 함유 한 비커에 트리카인 스톡 용액 2 ~3 밀리리터를 추가하십시오.
먼저, 상단에서 빛으로 스테레오 현미경을 켜고 배율을 16x로 조정합니다. 스폰지에 생선물을 담그고 현미경에 9센티미터 페트리 접시에 놓습니다. 초점을 조정하고 스테레오 현미경하에서, 텍스트 프로토콜의 도 1A에 자세히 설명된 바와 같이, 베이스에서 약 7밀리미터 의 미세 모세관의 끝을 잘라 내기 위해 iridectomy 가위를 사용합니다.
절단된 마이크로코세필증을 마이크로인젝터 장치의 바늘 홀더에 삽입합니다. Microloader 팁을 사용하여 제어 솔루션을 로드하여 적절한 흐름을 얻기 위해 주입 압력을 설정한 다음 바늘을 비웁릅니다. 그런 다음, 모세관의 끝에 주입 용액의 선택한 볼륨을 적재하여 기포가 없는지 확인합니다.
그물을 사용하여 성인 물고기를 잡은 다음 마취 솔루션으로 옮기습니다. 1~2분 후에 물고기가 수영을 멈추고 피퍼쿨럼의 움직임이 줄어들면 플라스틱 숟가락으로 물고기를 만져서 접촉에 반응하지 않도록 하십시오. 다음으로, 빠르고 조심스럽게 복부 측면을 위로, 젖은 스폰지의 홈으로 물고기를 전송합니다.
물고기의 머리는 운영자의 지배적 인 손에서 멀리 가리킨다. 스테레오 현미경에서, 조심스럽게 물고기의 피부 아래 박동 심장의 움직임을 관찰. 심장 박동 위와 삼각형 중앙에 있는 주입 점을 시각적으로 결정합니다.
모세관의 끝을 체드 축에 비해 30도에서 45도 사이의 각도로 삽입합니다. 미세 카세혈관 끝으로 피부에 부드럽게 침투하여 심낭에 침투합니다. 바늘이 심낭 내부에 있으면 마이크로 인젝터 장치의 페달을 눌러 주입을 완료하십시오.
주입 후 흉부에서 모세관을 부드럽게 철회하고 즉시 물고기를 시스템 물로 탱크로 옮겨 복구하십시오. 마취에서 완전히 회복 될 때까지 물고기를 모니터링합니다. 주사의 효과를 분석하려면 원하는 시점에서 심장을 수집하고 추가 분석을 위해 준비하십시오.
이 연구에서는, 외인성 화합물 및 단백질성인 얼룩말 물고기에 심장에 그들의 효과 공부 하기 위해 심근 구멍으로 전달 됩니다. 이 방법을 검증하기 위해, 안락사 된 물고기에 색상과 형광 염료를 주입하여 두 가지 테스트 실험을 수행합니다. 두 분석에서 전체 마운트 분석은 심실, 아트리움 및 구부동맥을 포함한 전체 심장의 라벨링을 보여줍니다.
이러한 결과는 심장 표면에 주입 솔루션의 효율적인 확산을 보여줍니다. 심장 연구를 위한 관면 주사 대 내 주사의 적합성을 비교하기 위해, 유사한 양의 DAPI는 두 가지 방법을 사용하여 주입된다. 그런 다음 5분 또는 120분 후에 하트가 고정됩니다.
DAPI 양성 세포는 어느 시점에서 복막 주사 후 심장에서 관찰되지 않습니다. 대조적으로, 내트라토라시성 주사는 심근에 DAPI 표지된 핵의 존재귀착됩니다. 이러한 결과는 관면 주사와 비교하여 심혼에 화합물의 전달을 향상시킨다는 것을 보여줍니다.
심장 재생 연구를 위한 이 방법의 적합성을 시험하기 위하여는, 심실은 극저온부상, 그리고 주사는 3 그리고 7 일 후에 극저온 상해 후에 능력을 발휘합니다. 심근과 부상당한 조직 모두 수많은 DAPI 양성 세포를 포함, 그대로 심장과 섬유 조직에이 염료의 효율적인 침투를 나타내는. 또한, 주입된 판로이드 AF649는 또한 peri-상해 지역의 심근세포및 몇몇 모집한 섬유아세포에 의해 통합됩니다.
이 실험은 약이 상복부를 교차하고 근본적인 심근으로 침투할 수 있다는 것을 밝힙니다. 염료를 사용하여 내트라토라시주사의 효율을 테스트한 후 심장에 주입된 단백질의 효과를 분석합니다. 이를 위해, 다양한 과정에 외인성 사이토카인의 효과가 조사된다.
심근세포 증식, 세포외 매트릭스 증착, 면역 세포 모집 및 심장 보호 유전자 발현의 생물학적 측면은 사이토카인의 내세포 주입에 의해 활성화됩니다. 이러한 결과는 내트라소라시드 주사가 다양한 연구체에서 뚜렷한 심장 조직에 미치는 영향을 연구하기 위해 단백질의 표적 전달에 적합한 전략을 제공한다는 것을 보여줍니다. 심낭에 바늘을 삽입하는 것은 성공적인 주입을위한 핵심 단계입니다.
바늘의 모양, 침투 각도 및 천자 부위는 바늘 삽입에 영향을 미치는 모든 요인입니다. 다음 또는 선행 내트라토라시성 주입, 하나는 심장 재생에 주입 된 분자의 효과를 분석하기 위해 극저온 부상을 수행 할 수 있습니다. 내트라시크 주사는 제브라피시에 사용되어 심장 전조를 연구했습니다.
CNTF에게 불린 단백질은 주입되고 심혼에 있는 세포 보호 및 프로 재생 프로그램을 강화하기 위하여 표시되었습니다.
