본 연구는 당뇨병과 소화 국립 연구소 신장 질환으로 소아 당뇨병 연구 재단 부여 5-2007-97 (VEP)을, 지원했다 보조금 R01DK064973 (VEP)를, R01DK48494 (LHP)를, T32DK07074 (SCE을 지원), K01DK083552 (MDK)를, 그리고 시카고 당뇨병 연구 및 교육 센터의 대학에 P60DK20595로. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIDDK 또는 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

1. 사전 분사 준비 <ol><li> 이전 주사 최소한 24 시간 동안 빠른 물고기. 이것은 장내 전구 (위) 내용을 비어있는 것입니다. 기본 금식 프로토콜은 깨끗한 탱크에 그들의 정상적인 밀도에서 물고기를 전송하는 것입니다, 다음 음식을 보류. (예 : 혈당 연구에 대한) 더 엄격한 조건을 필요로 장기 금식은 토론에 추가 고려 사항을 참조하십시오. </li><li> 코트 랜드 소금 솔루션 (페리 외., 1984)를 준비합니다. 100 ML 볼륨의 경우, 증류수에 다음을 해산 : 725 MG NaCl (124.1 ㎜) 38 MG KCl (5.1 ㎜) 41 MG 나 2 HPO 4 (2.9 ㎜) 24 MG MgSO 4 7H 2 O ∙ (1.9 ㎜) 16 MG CaCl 2 ∙ 2 시간 2 O (1.4 ㎜) 100 MG NaHCO 3 (11.9 ㎜) 4g Polyvinylpyrrolidone (PVP) (4 %) 1,000 USP 단위 헤파린 , 필터 소독 및 저장 4 ° C. </li><li> 현미경을 준비합니다. <ul><li> 유출의 경우 보호를 위해 플라스틱 랩과 현미경 기지를 커버. </li><li> 플라스틱 랩 위에 종이 타월을 넣어. 외과 테이블은 종이 타월 위에 앉아 것입니다. </li><li> 사전 조정 수술 테이블을보고 스폰지에 초점을 맞춤으로써 초점을. </li></ul> 팁 : 스폰지 위에 손가락을 넣고 거기에 중점을두고 있습니다. 물고기가 수술 테이블에되면 이것은 초점 조정을 제거 또는 추가 최소화합니다. </li><li> 물고기의 무게를. <ul><li> 1 / 생선 시설 물로 가득 약 3 500 ML의 비커를 입력합니다. </li><li> 테어 균형. </li><li> NET을 사용하여 물고기를 수집합니다. 멀리 간단히 종이 타월에 그물을 dabbing하여 그물과 물고기에서 초과 물을 윅. 비커에 생선을 전송합니다. </li><li> 물고기의 무게를. </li><li> 깨끗한 수조에 물고기를 전송합니다. </li><li> 자체 분류 탱크에 각각 무게 생선을 전송합니다. </li><li> 생선 무게에 따라 각각의 물고기에 대한 사출 볼륨을 계산합니다. </li></ul></li><li> 주사기 및 관련 사출 장비를 준비합니다. 주입을 위해, 우리는 35G beveled 강철 바늘과 10 μl NanoFil의 microsyringe을 권장합니다. 제조 업체의 지침에 따라 NanoFil 주사기와 silflex 튜브를 준비합니다. 주사기와 튜브의 모든 거품을 제거하는 것이 중요합니다. 주사기와 튜브를 작성 후, 펌프에 주사기를 탑재하고, 프로그램의 첫 번째 물고기에 대한 사출 볼륨을. </li><li> 수술 테이블을 준비합니다. <ul><li> 그것이 높이 약 20mm가되도록 부드러운 스폰지 (예 : # L800 - D, Jaece 산업 등) 잘라. 평면 얼굴에 깊은 10-15mm있는 상처를 확인하십시오. 이 상처는 분사를 위해 물고기를 개최합니다 구유입니다. </li><li> 60mm 페트리 접시에 스폰지를 설정합니다. </li><li> 적절한 크기의 피펫 팁 상자 뚜껑에 스펀지와 페트리 접시를 설정합니다. 뚜껑은 스폰지 온도를 유지하기 위해 물을 잡아 충분히 크게해야하지만, 그것은 방해하지 않도록 충분히 얕은해야합니다. 우리는 11.4 cm X 7.7 cm L W X 1.5 cm입니다 P200 팁 상자에서 뚜껑을 사용 D. </li></ul> (상자 뚜껑에 배양 접시에있는 스폰지) 함께 조립이 세 항목은 수술 테이블을 구성합니다. </li><li> 마취를 준비합니다. <ul><li> 생선 설비 물로 만들어진 큐브를 사용하여 얼음 조각을 만듭니다. </li></ul> 팁 : 일반적으로 얼음 큐브 트레이를 사용하여, 그것이 10-12 물고기를 마취 3 트레이를 취할 것입니다. <ul><li> 얼음 조각과 함께 깨끗한 얼음 양동이를 채우십시오. </li><li> 같은 2.4 리터 Rubbermaid 식품 저장 용기로 큰 용기에 수술 테이블을 넣어. </li><li> 바깥쪽 컨테이너와 수술 테이블에 어떤 시설 물 (따뜻한) 하거라. 따뜻한 물 시설의 보유를 근처 유지. </li><li> 외부 컨테이너에 체온계를 넣어. </li></ul></li></ol> 2. 마취, 분사 및 복구 <ol><li> 마취 바깥쪽 컨테이너 플러스 현미경에 인접한 외과 테이블을 배치합니다. 근처의 얼음 칩 버킷 있습니다. </li><li> 17 물의 온도를 내려줘 ° C 얼음 조각을 추가하여. 중요 :이 단계 17 ° C 아래에 가지 마세요. </li><li> 외부 컨테이너에 물고기를 전송하는 그물을 사용합니다. </li><li> 천천히 12 온도를 넘어뜨리고 ° C, 몇 분의 과정을 통해. 용기에 얼음 조각을 추가 </li><li> 모니터 생선 동작 : 17 ° C 또는 약간 낮은 물고기가 일반적으로 가로의 가슴 지느러미를 확산 말하다하고, 빠른 operculum의 움직임을 것입니다. 온도가 방울로, 물고기가 수영을 중지 더 느리게 그리고 마지막으로 수영합니다. 마취의 수술 비행기가 가까이이므로이 온다 중지하고 operculum의 움직임은 천천히합니다. 그것이 처리되는 반응하지 않는 경우 물고기 주입을위한 준비가 된 것입니다. 대부분의 생선, 12 ° C가 충분합니다. 큰 물고기는 추운 WA 필요할 수 있습니다터. </li><li> 필요한 온도가 포화에 스펀지에 (~ 12 ° C 또는 추워), 언론에 도달 때문입니다. </li><li> 그들은 물고기를 따뜻하게하고 처리하는 동안 마취를 꺼낼 수가없는 것입니다 충분히 있으므로 찬물에 손가락을 유지. </li><li> 차가운 손가락으로 부드럽게 스펀지의 여물에 생선을 전송합니다. 여물에 복부와 아가미와 함께 물고기를 놓습니다. </li><li> 신속 현미경 단계에 수술 테이블을 전송합니다. </li><li> 신속하게 작업, 신중하게 골반 지느러미 사이의 정중선에 바늘을 삽입합니다. 바늘은 cranially 가리 켜야하고 항문에보다 가깝게 골반 환상 골을 삽입할 수 있습니다. 당신은 바늘이 몸을 벽에 깊이 때 느낄 수있을 것입니다. 적절한 볼륨을 삽입하고 바늘을 철회. </li><li> 주입 후, 즉시의 따뜻한 물 (~ 28.5 ° C) 탱크 물 위에 스펀지에서 물고기를 발표하여 복구를위한 탱크. 다시 물고기를 전송 팁 : 물고기가 즉시 수영을 시작하지 않는 경우, 부드럽게 아가미쪽으로 물이 소용돌이로 복구하는 데 도움이됩니다. </li><li> 바늘을 확인합니다. 간혹 규모가 첨부된 수 있으며 다음 주사하기 전에 제거되어야합니다. </li><li> 이후 주사 들어, ° C 다음 생선을 도입하기 전에 17 백업 마취 챔버 물 온도를 가지고 따뜻한 설비 물을 사용합니다. </li></ol> 3. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2126/2126fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 0.5 MG / G 포도당이나 차량의 intraperitoneal 주사를 다음과 같은 대표적인 결과. 생선 주입하기 전에 72 시간 금식했다. x 축은 시간 후 주사를 보여줍니다. ± SEM을 뜻합니다.

<ol>
	<li>Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G., Hoar, W. S., Randall, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+methods+for+the+study+of+gill+physiology.">Perfusion methods for the study of gill physiology.</a> Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water. , 325-388 (1984).</li><li>Brown, L. A., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+restraint.">Anesthesia and restraint.</a> Fish Medicine. , 79-90 (1993).</li><li>Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostastis.">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis.</a> Zebrafish. 7, 205-213 (2010).</li><li>Chavin, W., Young, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+in+the+determination+of+normal+serum+glucose+levels+of+goldfish+Carassius+auratus+L.">Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L.</a> Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).</li><li>Groff, J. M., Zinkl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematology+and+clinical+chemistry+of+cyprinid+fish.+Common+carp+and+goldfish.">Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).</li><li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , 7-37 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (1995).</li><li>Iwama, G. K., Ackerman, P. A., Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetics.">Anaesthetics.</a> Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques. , 1-15 (1994).</li><li>Reavill, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+diagnostic+and+clinical+techniques+for+fish.">Common diagnostic and clinical techniques for fish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).</li><li>Stoskopf, M. K., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery.">Surgery.</a> Fish Medicine. , 91-97 (1993).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Intraperitoneal 주사 다섯 단계를 포함 : 금식 계량, 주입, 및 복구를 anesthetizing. 각 단계의 성공을 보장할 수 모범 사례가 없습니다. 성공은 건강한 물고기 환자뿐만 아니라 좋은 실험 결과를 포함하고 있습니다. 금식 : 24 시간 빠른이 장의 전구 비어해야합니다. 이러한 행위는 물고기 동물 문학 (예 : 브라운 1993)에서 발췌한 것입니다. 추가 금식 고려 사항은 아래 설명합니다. 장기 금식 : 우리는 72 시간 빠른하기 전에 주사하는 기본 수준으로 혈당을 감소하는 데 필요한 것으로 나타났습니다 (임스 외, 2010.). 우리는 또한 포도당 연구 물고기가 제대로 금식되는 것을 보장하기 위해 필요한 몇 가지 절차가있다는 것을 발견했습니다. 깨끗한 탱크 (바닥에 부스러기없이)로 시작합니다. 탱크는 명확하게 &#39;금식&#39;으로 분류, 오프라인되어야하고, 위치에 열정 생선 관리 직원이 그들을 먹여 살리지하지 않습니다 어디에. 탱크의 외부 환경을 평가하고 스트레스가 혈당 (Chavin 영, 1970.; 그로프 외, 1999)을 마련하는 것으로 알려져으로 교란에서 강조되는 물고기를 방지하기위한 조치를 취할. 예를 들어, 우리는 라디오가 물고기 탱크를 들고 있던 벤치에서 매일 운영어진 금식 실험을했다. 우리는 혈당이 비정상적으로 높은이고 물고기는 진동에 의해 강조되었다 결론 발견했습니다. 또 다른 스트레스가 사람을 너무 많이들이는 것입니다. 생선 좋은 생선 축산 관행과 준수 밀도에 보관해야합니다. 추천, 브랜드 외를 참조하십시오. (2002 년)와 웨스 터 (1995). 우리는 9리터 탱크 (해당 볼륨의 일부를 차지하지 구슬 3 레이어)에 10-12 물고기의 밀도에 우리 생선 금식 좋은 결과를 있었다. 남녀를 분리하는 것은 스트레스의 원인이 될 수 있습니다, 그래서 우리는 빠른 동안 혼합 성별 인구를 유지하는 것이 좋습니다. 이것은 계란이 여자랑 수있다는 것을 의미하고, 계란 그들이 먹지 않을 수 있도록 분리된해야합니다. 달걀을 격리하는 간단한 방법은 구슬로부터 2-3 레이어와 탱크 바닥을 커버하는 것입니다. 수질은 계란과 쓰레기를 제거하여 매일 탱크의 물을 10-15 % 정도를 교체하여 유지되어야합니다. 몰래 빼내고, 계란과 쓰레기를 제거 잘 작동합니다. 무게 : anesthetized되지 않은 생선 무게 경우, 치료는 정확한 계량을 보장하기 위해, 비커에 그물에 물을 전송을 최소화하기 위해 이동해야합니다. 그물은 (생선) 종이 타올에 blotted 경우, 초과 물의 대부분은 제거할 수 있으며 무게는 정확하게 측정할 수 있습니다. 그것은 전에 무게로 물고기를 마취하기 쉬울 수 있지만, 우리는 하루에 두 번 생선을 anesthetizing의 가능한 효과를 테스트하지 않았습니다. 우리는 anesthetized 후 다시 무게 물고기 다음 그물 / 방법을 모래 바닥과 함께 먼저 생선을 무게로 우리의 기술을 테스트하고, 부드럽게 건조 blotted있다. 우리는 방법 사이의 무게에 큰 차이를 찾을 수 없습니다 (P = 0.7927, T - 테스트). 또한, 우리는이 그물 /가 (NO 모래 바닥) netted이므로 단순히 즉시 비커에 생선을 전송에 비해, 방법에 영향을 혈당을 모래 바닥 여부를 테스트했습니다. 우리는 두 가지 전송 방법 사이의 혈당 수준에 상당한 차이를 찾을 수 없습니다 (P = 0.2241, T - 테스트). Anesthetizing : 화학 마취 많은 연구에 적합한 수 있습니다. 많은 anesthetics이 (tricaine/MS-222 (브라운, 1993)를 포함), 혈당을 올리기 때문에 여기에서 우리는 대안으로 냉수 마취를 증명하고있다. 이전 연구에서, 우리는 차가운 물 (임스 외., 2010) zebrafish에서 혈당을 인상하지 않는 것으로 나타났습니다. 콜드 워터 마취의 경우, 온도가 천천히 감소한다. 감소의 비율은 작은 물고기가 큰 물고기보다 아래에가는과 함께 물고기의 크기에 따라 달라 보인다. 분사에 따라, 당신은 물고기 (아래 참조) 마취에서 너무 느리게 회복 것을 관찰할 수 있습니다. 시작 온도는 온도가 너무 빠르게 감소합니다 너무 낮은 경우 또는 경우 중이 발생할 수 있습니다. 시작 온도는 물을 입력시 생선 숨어 경우 옆으로 너무 낮습니다. 시작 온도가 맞다면, 물고기는 처음의 균형을 유지합니다. 그것은 수평 위치는 가슴 지느러미를 회전 말하다하고, 빠른 operculum의 움직임을 것입니다. 일반적으로, 그것은 수영을합니다. 온도 감소로, 움직임이 저하되고 물고기는 균형을 잃게됩니다. 물고기가 반응하지 않고 처리할 수있을 때 마취의 수술 비행기에 도달입니다. 외과 마취 물고기를 유지하기 위해, 손가락, 추울 때문에 생선을 취급하기 전에 물에 보관해야합니다. 스폰지는 또한 물고기를 anesthetizing에 사용되는 물 같은 온도에서 추위 보관해야합니다. sufficie는 물로 스폰지를 포화하는 것이 중요하다물고기가 그것에 배치되면 마취를 유지하는 ntly 감기. 사출 : 이전 사업 주사로, 당신이 신체 벽 두께의 감각을 얻으려면 적어도 하나의 물고기를 해부하다 할 수 있습니다. 이것은 바늘이 복강를 입력 삽입할 필요가 얼마나 멀리 당신이 판단하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 당신이 주사 바늘을 삽입으로, 당신은 바늘이 복강를 입력하면 신체 벽은 &quot;줄&quot;느낄 수 있습니다. 주사하는 동안 환자가 행복하게하기위한 조치를 취할. 스폰지가 주입하는 동안 되살리는에서 물고기를 방지하기 위해 정확한 온도 차가운 물로 포화되어 있는지 확인하십시오. 잘 포화 부드러운 스펀지는 비늘과 피부의 커버 가래의 손상을 최소화하는 것이 중요합니다. 잘 포화 스펀지는 아가미가 aerated 유지에도 중요합니다. 우리는 높은 재료 아래에 나열된 거품 스폰지를 권장합니다. 마지막으로, 일단 물고기가 anesthetized이며, 물고기가 아래에되는 시간을 최소화하기 위해 신속하게 작동합니다. 복구 : 물고기가 거의 따뜻한 물 탱크를 입력시 마취에서 회복한다. 물고기는 회복 속도는 아가미쪽으로 소용돌이 물을 부드럽게, 즉시 수영을 시작하지 않으면. 복구가 느리다면, 물고기가 너무 빨리 아래에 가서 당신은 적절하게 마취 절차를 조정해야합니다. 느린 회복의 원인은 Anesthetizing 아래에 설명합니다.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Foam Sponge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jaece Industries</td>
<td>L800-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 mm Petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipet tip box lid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>not too deep, e.g. 1.5 cm</td>
</tr>
<tr>
<td>Plastic storage container</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>deep, e.g. 7 cm </td>
</tr>
<tr>
<td>Thermometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crushed ice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>made from facility water</td>
</tr>
<tr>
<td>Warm facility water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1 liter or more</td>
</tr>
<tr>
<td>500 ml beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for weighing</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoFil syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
<td>NANOFIL</td>
<td>or Hamilton syringe</td>
</tr>
<tr>
<td>35 gauge needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>NF35BV-2</td>
<td>beveled</td>
</tr>
<tr>
<td>Silflex tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>SILFLEX-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraMicroPump III and Micro4 controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>UMPS-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foot switch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>15867</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paper towels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cortland salt solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intraperitoneal injection into adult zebrafish

화학적 zebrafish 치료를위한 편리한 방법은 그것이 물고기에 의해 촬영되는 탱크 물에 시약을 소개하는 것입니다. 그러나,이 방법은 어려운 시약을 흡수 또는 물고기 당 최대 촬영 어느 정도 알고 있습니다. 신진 대사 연구 특히 이들과 관련된 몇 가지 실험 질문은, 더 나은 무게에 따라 각 물고기에 정의된 수량을 제공함으로써 해결될 수 있습니다. 여기 우리는 성인 zebrafish에 intraperitoneal (IP) 주입을위한 방법을 제시한다. 사출은 복강에 골반 환상 골에 후부 있습니다. 이 절차는 큰 물고기에 사용되는 동물의 적응 방법이다. 우리가 제로 사망률을 관찰 것처럼 그것은 안전합니다. 또한, 우리는 127 주사의 단 5 밖에서 주입 사이트에서 출혈이 볼 수 있고,이 경우 각각의 출혈이 간단한, 지속적인 몇 초 정도 있었고, 분실 혈액의 수량이 작은되었습니다. 이 절차와 성공, anesthetizing, 사출 및 복구 무게, 금식 등 여러 단계를 통해 물고기의 부드러운 핸들링이 필요합니다. 주의 사항이 절차를 통해 스트레스를 최소화하기 위해 필요합니다. 우리의주의는 작은 분사 볼륨 및 35G 바늘을 사용하여 포함됩니다. 우리는 osmotically 민물고기에 대한 균형있는 차량으로 코트 랜드 소금 솔루션을 사용합니다. 아가미의 폭기는 사출 자체 동안 물이 포화 스폰지 내의 여물 물고기를 누른 먼저 느린 operculum의 움직임을 허용 마취 수술 비행기로 물고기를 가져다하여 사출 과정 동안 유지하고, 두번째입니다. 우리는 포도당을 주입하고 혈당 수준의 상승과 정상의 후속 수익을 모니터링하여 IP 주입의 유틸리티를 보여줍니다. 스트레스가 teleost 물고기의 혈당을 증가하는 것으로 알려져 있습니다, 우리는 차량 주입 및 비 주입 성인 혈당 수준을 비교하고 절차는 혈당에 큰 상승을 발생하지 않는 것으로 나타났습니다.

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Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

우리는 성인 zebrafish에 intraperitoneal 주사를 보여줍니다. 우리는 Micro4 컨트롤러와 UltraMicroPump III에 의해 통제 10 μl NanoFil microsyringe을 사용합니다. 이 예제는 마취로 찬물의 사용을 포함합니다.

성인 Zebrafish에 Intraperitoneal 사출

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

intraperitoneal-injection-into-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

57.0K 조회수.  The University of Chicago. 우리는 성인 zebrafish에 intraperitoneal 주사를 보여줍니다. 우리는 Micro4 컨트롤러와 UltraMicroPump III에 의해 통제 10 μl NanoFil microsyringe을 사용합니다. 이 예제는 마취로 찬물의 사용을 포함합니다.

비디오: Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

성인 Zebrafish의 전체 신장 마로우의 이식

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

연구

생물학

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus. The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

여성 A. aegypti 모기에의 dsRNA의 분사

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

Zebrafish의 두뇌 뇌실 주입

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

성인 Zebrafish에서 레트로 - 궤도 분사

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

성인 Zebrafish에서 기관의 해부

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

사출 및 Electroporation에 의해 Zebrafish Otocyst으로 MIF Morpholinos 직접 배달 내이 (内耳)의 개발 미치는 영향

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

직접 성인 Zebrafish의 신장에 세포의 이식

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

성인 Zebrafish의 신장의 해부

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

생성중 성인 Zebrafish 테일 핀으로 Morpholinos의 생체내 Electroporation에

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...