This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.

1. 전지 도금 및 형질 <ol><li> 세포 배양 후드에서, 플레이트 ~ 300,000 ~ 500,000 SN56 세포 (박사 제인 Rylett의 일종 선물) 35mm의 유리 바닥 공 초점 접시에와 (둘 베코의 수정 이글 배지, DMEM는, 보충 사전 형질 미디어 커버 10 % FBS). </li><li> 증식 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 하룻밤 동안 세포를 배양한다. 참고 : 세포가 약 50 %의 형질 전환 이전에 70 %의 합류해야한다. </li><li> 세포 배양 후드에서, 형광 단백질을 발현하는 플라스미드 트랜 세포는 형광 단백질 여기 구획 표식 (태그 리소좀 관련 막 단백질 1 LAMP1를 태그 TGN 마커 (GALT-CFP 시안 형광 단백질에 결합 갈 락토 실 전이 효소)를 태그 MRFP), 및 paGFP (βAPP-paGFP 태그 관심의 단백질). (이러한 구조는 이전 30 기재되어있다) </li><li> 형질 전환 시약 및 플라스미드 DNA의 F와 세포를 품어또는 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 24 시간. 최적의 균형 세포 독성 및 형질 전환 효율을 형질 에이전트의 5 μL (예를 들어, 리포 펙 타민 2000)에 DNA의 ~ 2 μg의 비율을 사용합니다. 실제 농도는 다른 플라스미드에 최적화 될 필요가있다. 여기에 설명 된 실험에서, 1 μg의 βAPP-paGFP의 / 공 초점 접시, 램프 1-MRFP 0.3 μg의 / 공 초점 요리 및 GALT-CFP의 0.2 μg의 / 공 초점 접시를 사용합니다. 주 : 사용 된 플라스미드의 양은 형질 전환 효율에 의존 할 것이다. </li><li> 신경 세포주 : 단계 1.4 후, 세포 배양 후드에서 미리 형질 매체를 제거하고 1 mM의 24 시간 동안 환상 AMP (dbcAMP)를 dibutyryl 0.1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 ML의 DMEM에 SN56 세포 분화. </li></ol> 2. 현미경 무대 준비 <ol><li> 사전 따뜻한 인산염 완충 식염수 (PBS)와 37 ° C에 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS). imagi 전에 워밍업 현미경 단계37 ° C에 NG. </li><li> 두 번 PBS로 세척 세포는 분화 미디어를 제거하고 37 ℃에서 HBSS 2 ㎖로 교체합니다. 현미경 스테이지에 배치 세포를 37 ℃로 가온. 참고 : 세포가 HBSS 약 1.5 시간 동안 실행 가능한 있습니다. </li><li> 공 초점 판 온도가 현미경 단계와 평형을 5 ~ 10 분을 허용합니다. </li></ol> 골지을 통해 ROI를 3. 사진 활성화 <ol><li> 현미경의 접안 렌즈로, GALT-CFP, 램프 1-MRFP 및 βAPP-paGFP로 형질 세포를 찾을 수 있습니다. <ol><li> 높은 배율 (즉, 63X 또는 100X)와 오일 침지 렌즈를 사용합니다. 형광의 시각적 형태를 들어, 및 로다 민 (MRFP 형광 용) (CFP 및 GFP의 형광을위한) FITC를 시각화 할 수있는 설정 필터를 사용합니다. </li></ol></li><li> 1 μm의 각 채널에 대한 공 촛점 슬라이스를 설정합니다. 저해상도 이미지를 촬영. </li><li> 이미지 작물 관심의 세포. </li><li> 조정 손잡이를 사용하여 수동으로 설정할셀의 중앙에 초점면. 이것은 일반적으로 핵이 가장 큰 셀의 일부분이다. </li><li> TGN (GALT - CFP 형광) 내 (로아) 관심의 3-5 원형 영역을 그립니다. <ol><li> (즉, 자이스 혈구 LSM 프로그램)의 ROI를 그리려면 명령 콘솔에서 &#39;편집 투자 수익 (ROI)&#39;버튼을 선택합니다. </li><li> 원형 투자 수익 (ROI) 버튼을 선택합니다. </li><li> 클릭 GALT - CFP에게 셀의 긍정적 인 영역을 통해 드래그합니다. 참고 : 많은 현미경 사진 표백 패키지는이 기능을 가지고있다. </li></ol></li><li> 중첩 로아와 셀의 이미지를 가져 가라. 나중에 참조 로아의 사본을 저장합니다. <ol><li> 이미지에 ROI를 저장하려면, &#39;매크로&#39;버튼을 선택합니다. </li><li> &#39;CopyRoisToOverlay&#39;(C : /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb 파일 경로)를 시작하는 &#39;로드&#39;버튼을 누릅니다. 참고 : 475-525 나노 미터 (CFP) 대역 통과 (BP), 500-530 nm의 BP (GFP)가 장착 된 공 초점 현미경을,및 560 nm의 긴 패스 (LP) 필터 세트가 필요합니다. 458 nm에서 488 nm의 방출 및 540 nm의 방출에 대한 헬륨 네온 레이저를위한 아르곤 레이저도 필요합니다. </li></ol></li><li> 설정 표백제 시간 코스에 대한 현미경을. <ol><li> 최대 전력 레이저 다이오드 (25 mW의 405 nm의 레이저)를 설정합니다. 주의 : 과도한 사진 활성화가 세포막에 사진 독성 또는 손상이 발생할 수 있습니다. 망막 손상을 방지하기 위해 보안경을 사용하십시오. </li><li> 설정 이미징의 120주기에 대한 현미경을. 주 : 촬상 한 사이클 내에서 ROI를 표백 셀 전체의 촬상 이루어져있다. 이 표백제 시간 코스입니다. </li><li> 모든 이미지 후 20-30 반복 만의 ROI (사진 활성화)을 표백하기 위해 현미경을 설정합니다. 이미지가 달라질 이미지와 표백제까지의 시간. 각주기는 약 30 초, 그래서 이미지 사이의 시간 지연을 설정합니다. 주 : 각 사이클의 촬상 부는 화상의 크기에 따라 약 15 ~ 30 초 걸린다. 각 소유주의 표백나는 약 50 밀리 초입니다. 20 반복에 대한 모든 4 로아의 표백 각 표백제 / 이미지 사이클의 끝에서 4 초를 취할 것입니다. </li></ol></li><li> 표백제 시간 코스를 시작합니다. </li><li> 15 분 (이미징 및 표백의 30주기) 후 표백을 끄고 있지만, 셀의 이미지를 캡처 계속합니다. 참고 : 분 &#39;펄스&#39;기간 인 0-15 시간. </li><li> βAPP-paGFP의 틈새를 따라, (표백)없이 45 분 동안 이미지를 캡처 계속합니다. 참고 : 분 &#39;추적&#39;기간 인 15-45 시간. </li><li> 단계 6에 기재된 분석 방법을 사용하여, 각 채널에 표면함으로써 (여기서, LAMP1-MRFP) 관심 구획이자 (여기서, βAPP-paGFP)의 단백질을 공동 - 지역화. </li></ol> 4. 다운 스트림 구획을 결정 <ol><li> (이 실험에서) 리소좀 최종 구획되어 있는지 확인하려면 단백질이 리소좀에 축적하는 원인이 막 투과성 단백질 분해 효소 억제제를 추가합니다.<ol><li> βAPP를 들어, 0.5 μm의 L685, 458 (특정 γ 크레타 제 억제제) 하룻밤 또는 이미징 전에 30 분 동안 100 μM의 클로로퀸 (deacidifies의 리소좀)를 사용합니다. </li></ol></li><li> 3.8 - 3.1 단계에서와 같이 세포와 photoactivate를 찾을 수 있습니다. </li><li> βAPP-paGFP는 분열의 부재에 축적 경우 이미지 (사진 활성화 제외) 추가 45 분 동안 세포 확인합니다. </li><li> 단계 6에 기재된 방법에 따라 리소좀 (혹은 다른 하류 구획실)로 단백질의 전달 및 후속 간극을 분석한다. </li></ol> 5. 골지 내 사진 활성화의 정확성을 보장 <ol><li> 37 ° C로 예열 HBSS. </li><li> 모든 공 초점 판 HBSS에 66 μm의 nocodazole (처리) 또는 DMSO (제어)으로, 이미징 될 수 있도록, 2 ml의 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 하나의 공 초점 판, 피펫 (2) 37 ° C HBSS ml의 16.60 mM의 nocodazole 재고에서 nocodazole의 7.96 μl를 추가하십시오. </li><li> 제어 그래서lution, 피펫 2 2 ML 튜브에 37 ° C HBSS ㎖의 DMSO의 7.96 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 촬영하기 전에 5 분 동안 nocodazole 또는 DMSO와 HBSS에 세포를 품어. </li><li> 단계 3.1에서와 같이 세포를 찾아보십시오. </li><li> photoactivati​​on 전에 사진 정품 인증 기간 후 Z - 스택을하기 위해 현미경을 준비합니다. <ol><li> &#39;Z 스택&#39;버튼을 클릭합니다. 빠른 XY를 사용하여 스캔을 시작합니다. </li><li> 셀의 상단에 현미경 조절 노브와 초점면을 조정합니다. 눌러 &#39;마크 먼저&#39;스택의 제 1 위치에 설정한다. </li><li> 셀의 하단 현미경 조정 노브 (유리에 가장 가까운)과 초점 평면을 조정한다. 를 눌러 &#39;마크 최근&#39;스택의 마지막 위치를 설정합니다. </li><li> Z 스택 패널에서 &#39;Z 절편&#39;버튼을 누릅니다. 1 μm의 &#39;간격&#39;을 설정합니다. 높은 공간 해상도가 작은 스택 간격을 스택,하지만 더 많은 이미지가 필요합니다 참고 :스택 촬상 기간을 길게 취할. </li></ol></li><li> 단계 3.7에서 3.8 사이에 기술 된 바와 같이, 셀을 표백. 15 분 (30 프레임)로 0 분에서 사진 활성화 및 이미지. </li><li> 30 프레임 후에 영상을 중지합니다. 즉시 비디오의 이미지를 저장합니다. 주의 :이 제 2 이미징 시퀀스를 시작하기 전에 저장되지 않는 경우에는 일부 현미경 먼저 영상을 겹쳐있다. </li><li> 동영상을 저장 한 후, 즉시 단계 5.5에서 매개 변수를 사용하여, Z - 스택을 획득. </li><li> 단계 6에 기재된 바와 같이, CFP-GALT (또는 다른 골지 마커)로 βAPP-paGFP 동시 - 지역화. CFP 빠르게 photobleaches 및 이미징 기간 말까지 표시되지 않을 수 있습니다 참고. colocalization을가 GALT - CFP 가능하지 않을 수 있습니다. colocalization을해야하는 경우, 걸트에 태그를 MRFP를 사용합니다. </li></ol> 6. 소포 필터링 및 colocalization을 <ol><li> 구획의 표면 (예 : 램프 1-MRFP)과 단백질 (을)를 만들기 위해 분석 프로그램 (예를 들어 Imaris)를 사용하여F의 관심 (예 βAPP-paGFP). </li><li> 상단 메뉴 표시 줄에서 능가 버튼을 클릭하여 분석 프로그램의 &#39;능가&#39;​​섹션을 입력합니다. </li><li> 가장 왼쪽 패널 (왼쪽에서 5 번째 버튼)의 상단 표면의 마법사 버튼을 선택합니다. </li><li> 소포 (즉 βAPP-paGFP 형광, 관심의 단백질)를 필터링 할 채널을 선택합니다. </li><li> 다음 마법사와 언론 분야에서 가장 큰 소포의 직경을 제출하여 배경 빼기를 수행합니다. 분석 프로그램이 자동으로 선택 - 관심의 채널 영역 - 필드의 최대 소포로부터 유도 된 임계 값에 기초하여. <ol><li> 수동으로 필요한 경우 선택을 구체화하는 임계 배경을 조정합니다. </li></ol></li><li> 임계 값 선택 화면의 아래쪽에 결합 된 표면을 분리하는 &#39;분할 감동 객체의 옵션을 선택합니다. 참고 : 많은 소포가 밀접로 그룹화하는 경우게델, 한면에서 이러한 개체 분석 프로그램 의지 그룹. <ol><li> 10 ~ 15 대표 소포를 선택하고 평균 소포 직경을 계산하고 마법사에 결과를 입력합니다. </li></ol></li><li> 증가 또는 &#39;품질&#39;(각 스폿의 중앙에 채널의 강도)에 임계 값을 감소시킴으로써 선택된 시드 포인트를 구체화. 주 : 관심있는 채널의 표면이 생성됩니다. 선택면의 추가적인 정련이 시점에서 수행 될 수있다. 각 소포의 화소 수에 기초하여 임계 소체. </li><li> 이 표면과 원래 채널 마스크. 마스크, 표면 생성 마법사 (연필)의 왼쪽에서 4 번째 탭을 선택합니다. </li><li> &#39;모두 마스크&#39;를 선택합니다. 관심있는 소포와 새로운 채널이 생성됩니다. 주 : 마스크 프로세스 동안 원래 채널을 복제하는 옵션이 제공된다. 원래의 데이터가 저장해야하는 경우이 옵션을 선택합니다. </li><li> 반복의필터링되지 않은 채널 (예 : 램프 1 MRFP, 구획) 6.7을 통해 TEPS 6.1. </li><li> 상단 도구 모음에서, colocalization을 도구를 선택합니다. <ol><li> 상단 패널에서 colocalized 할 수있는 채널의 히스토그램 표시로, 최근에 만들어진 마스크​​ 채널을 선택합니다. </li><li> 가능한 모든 데이터를 선택합니다. 때로는 분석 후 존재하는 어두운 픽셀이 있습니다. 히스토그램에서 이러한 픽셀을 선택하지 마십시오, 그들은 결과를 왜곡합니다. </li><li> 오른쪽 패널에서 &#39;Coloc 채널 구축&#39;을 선택합니다. 이것은 단지 colocalized 픽셀을 포함하는 새로운 채널을 생성합니다. 데이터는 &#39;채널 통계&#39;버튼 아래에있는 동일 패널 (Panel)에있을 것입니다. 데이터를 .csv 파일로 내보낼 수 있습니다. </li><li> &#39;재료의 비율이 colocalized&#39;통계를 사용합니다. 이 옵션은 계정에 개체의 픽셀 크기의 강도를합니다. </li></ol></li></ol>

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H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+photolabeling+of+proteins+using+photoactivatable+GFP.">Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP.</a> Methods. 32 (4), 445-450 (2004).</li><li>Hirschberg, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+secretory+protein+traffic+and+characterization+of+golgi+to+plasma+membrane+transport+intermediates+in+living+cells.">Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells.</a> J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).</li><li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER.">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).</li><li>Hailey, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+supply+membranes+for+autophagosome+biogenesis+during+starvation.">Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation.</a> Cell. 141 (4), 656-667 (2010).</li><li>Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Precursor+Protein+is+rapidly+transported+from+the+Golgi+apparatus+to+the+lysosome+and+where+it+is+processed+into+beta-amyloid.">The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid.</a> Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).</li><li>Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+logic+underlying+the+axonal+transport+of+cytosolic+proteins.">Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins.</a> Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).</li><li>Herl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+amyloid+precursor+protein+affect+its+interactions+with+presenilin/gamma-secretase.">Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase.</a> Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).</li><li>Lorenzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Direct+Transport+of+Cell+Surface+APP+to+the+Lysosome+defines+a+novel+selective+pathway.">Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway.</a> Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).</li><li>Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+'Swedish'+amyloid+precursor+protein+variant+in+neuro2a+(N2a)+cells.+Evidence+that+cleavage+at+the+beta-secretase";site+occurs+in+the+golgi+apparatus.">Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus.</a> J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).</li><li>Thinakaran, G., Koo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+Precursor+Protein+Trafficking,+Processing,+and+Function.">Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).</li><li>Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Activation+and+Excitation+Properties+of+PA-GFP+in+the+720-920-nm+Region.">Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region.</a> Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).</li><li>Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+export+of+the+vesicular+stomatitis+virus+G+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+requires+a+signal+in+the+cytoplasmic+tail+that+includes+both+tyrosine-based+and+di-acidic.">Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic.</a> 11 (1), 13-22 (2000).</li><li>Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+products+of+amyloid-beta+precursor+protein+are+sorted+to+distinct+carrier+vesicles+that+are+independently+transported+within+neurites.">The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites.</a> J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계 나 이해 관계의 충돌이 없습니다.

이러한 기술은 후속 매매 및 분열을 시각화 TGN에 paGFP 태그 막 단백질의 정확한 광 활성화를 설명한다. paGFP 25 일 전 십 년간 생성 된 반면,이 하류 구획에 초기 단백질의 인신 매매를 수행하는 정확한 사진 활성화의 첫 번째 예입니다. APP-paGFP를 사용하여 이전의 연구 사진을 활성화 골지 (11)로 간주 된 세포의 요정 핵 영역을 구성한다. 그러나, 우리의 현미경 사진, 리소좀, 초기 엔?...

알츠하이머 병 (AD)의 특징은 노인성 플라크와 뇌의 신경 섬유 엉킴 (NFTS)의 존재이다. 노인성 플라크의 주성분은 β - 아밀로이드 (Aβ)입니다. Aβ는 그 전구체에서 파생 된; 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 1. 응용 프로그램의 아밀로이드 분열은 β-크레타 제 2에 의해 APP에서 ectodomain의 제거를 시작합니다. 남은 잔류 물을 99 카복실 말단 단편 (CTF)는 Aβ 3-7을 생산하는 γ 세 크레타 제에 의해 절단 될 수있다. 많은 실험 엔도 솜 / 리소좀 시스템으로 세포 표면에서 내재화 후 세포 표면 APP의 분열을 설명하고 있지만, 최근 다수의 연구는 APP의 세포 트래 피킹 또한 그 처리 8-11을 조절하는데 중요하다는 것을 제안 하였다. γ 크레타 제 저해제 및 아밀로이드 베타 immun으로 Aβ의 수준을 조절에서 시도의 숫자가 있었다otherapies. 그러나, 이들 치료법에 대한 최근의 임상 시험은 경우에 피해를 야기 12, 더 유익 없었다하고. 아밀로이드 베타의 생산을 조절하는 개발되지 않은 전략은 APP의 하위 세포 현지화 및 γ-크레타 제의 상호 작용을 변경하는 것입니다. 골지, 세포막, 그리고 엔도 좀 / 리소좀은 모든 APP의 γ-절단 가능한 로케일로 제안되었다. 우리의 실험실에서 연구 APP 및 γ-크레타 제는 리소좀 막 (13)의 거주자 단백질이 있음을 시사한다. 또한, 우리는 리소좀 γ 크레타 제는 산성 최적의 pH (13)를 가지고 있음을 발견했다. 또한, 클로로퀸 또는 NH 4 CL와 엔도 솜 / 리소좀 시스템의 알칼리화, Aβ (14)의 생성을 감소하는 것으로 나타났다. -γ 크레타 제 억제 또는 녹아웃 또는 프레는 리소좀 15-17에서 APP-CTFs 축적으로 이어집니다. 또한, 응용 프로그램 엔도 시토 시스를 방해하는 Aβ 생산 18 ~ 20을 낮 춥니 다. 초기 단백질과 엔도 솜 / 리소좀 시스템에서 재활용 단백질 정렬 역으로 골지의 중요성에도 불구하고, 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매는 세부 (21)에 연구되지 않았다. 최근 작품은 앱이 retromer 단지와의 상호 작용을 통해 트랜스 골지 네트워크 (TGN)로 재순환 될 수 있음을 보여 주었다. retromer 단지의 다운 규제는 Aβ 생산 8,22-24을 감소시킨다. 그러나, 골지에서 응용 프로그램의 출구는 잘 연구되지 ​​않았다. 이러한 트랜스페린 수용체로 세포 표면 단백질의 세포 내 이입을 다음 있지만, 쉽게 표시 및 준수, 세포 내 단백질의 인신 매매를 따라하는 것은 더 어렵습니다. 사실, 몇 가지 단백질은 세포 내 인신 매매는 몇 군데 있었다. 이러한 사진 기동-GFP (paGFP), 형광 단백질 태그의 출현은 세포 내 인신 매매를 조사하기위한 새로운 도구를 제공하고 있습니다. 사진 - 기동-GFP는 GF의 한 형태이다합성 후 거의 보이지이지만, 413 nm의 레이저 광에 의해 활성화 된 후에 강한 녹색 (GFP)의 형광을 개발하고이 신호 (25, 26) 일 동안 안정하다 P. paGFP를 사용 제물 리소좀 단백질 intralysosomal 매매를 입증하는 데 사용 된 막 단백질 1 (LAMP1) (25), 소낭 구내염 바이러스 당 단백질 (VSVG, 분비 경로의 마커) (27)의 세포 표면에 전달하고, 퍼 옥시 솜의 회전율 28 및 29 autophagosomes. 생균에 TGN에서 APP의 정렬을 가시화하기 위해, 우리는 C 말단에 광 활성화 가능한 (paGFP)에 결합 APP의 마지막 112 아미노산을 발현하는 플라스미드를 설계 (30) (βAPP-paGFP라고 함). 우리는 또한 전체 길이 응용 프로그램과 함께 이러한 실험을 수행하고 비슷한 결과를 달성했다; 그것은 밝은 이미지를 제공하기 때문에 ΒAPP 구조가 여기에 사용됩니다. 우리는 다음 사진을 활성화 &amp;# 946;에만 TGN에서 APP-paGFP, TGN 마커 갈 락토 (GALT)에 의해 경계가있다. 앱이 핵 주변 지역에서 빠른 축삭 앱의 운송 및 통관을 시각화 paGFP 태그되었지만,이 하나 신중하게 정의 함에서 다른 11,31,32에 응용 프로그램 매매의 첫 번째 데모입니다. 여기서 우리는 정확한 TGN 내 사진 활성화 및 다운 스트림 구획과 리소좀 (30) 후속 절단 및 통관에 응용 프로그램의 출구를 보여줍니다. 골지 내의 정확한 광 - 활성화 단백질은 다른 시스템에 널리 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>35 mm glass bottom culture dishes&amp;nbsp;</td><td>Matek</td><td>P-35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11995-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>dibutyrl cyclic AMP</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Heat in activated Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Heated Microscopy stage insert P</td><td>PeCon GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tempcontrol 37&amp;ndash;2 digital 2-channel</td><td>PeCon GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser</td></tr><tr><td>Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L685, 458&amp;nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>565771</td><td>dissolved in DMSO</td></tr><tr><td>cholorquine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C6628&amp;nbsp;</td><td>dissolved in water</td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td>dissolved in DMSO</td></tr><tr><td>Dimethyl sulphoxide&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Imaris&amp;nbsp;</td><td>Bitplane</td><td></td><td>with colocalization package&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

imaging the intracellular trafficking of app with photoactivatable gfp

베타 아밀로이드 (Aβ)는 알츠하이머 병 환자의 뇌에서 발견 노인반의 주요 구성 성분이다. Aβ는 β 및 γ - 세 크레타에 의해 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 순차적 분열에서 파생됩니다. AD 병리에 Aβ의 중요성에도 불구하고, 이러한 분열의 세포 내 현지화가 잘 확립되어 있지 않습니다. 우리 실험실에서 직장 및 다른 세포 표면에서 내재화 후 APP 처리에 엔도 솜 / 리소좀 시스템 연루. 그러나, 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매는 상대적으로 파악 하였다입니다. 세포 표면 단백질은 많은 라벨링 기술에 수정할 수있는 반면, 골지체에서 막 단백질의 거래를위한 다음의 간단한 방법은 없다. 이를 위해, 우리는 C- 말단에서 사진 기동 GFP (paGFP)로 태그 한 응용 프로그램 구조를 만들었습니다. 합성 후 paGFP 낮은 기저 형광을​​ 가지고 있지만 413 nm의 빛을 t로 자극 될 수있다O 강한, 안정적인 녹색 형광을 생산하고 있습니다. 사용하여 골지 마커 락토 트랜스퍼 대상 시안 형광 단백질 (GALT-CFP)에 결합 된, 우리는 트랜스 골지 네트워크 APP photoactivate 정확하게 할 수있다. 이 형광 식별 하류 구획 (트래픽) 초기 엔도 좀 (Rab5), 후반 엔도 좀 (Rab9)와 리소좀 (램프 1)에 대한 구획 마커 단백질 태그로 사진 활성화 APP-paGFP은 다음에 할 수 있습니다. 또한, 클로로퀸 또는 γ 세 크레타 제 억제제 인 L685, 458을 포함 APP 처리에 억제제를 사용하여, 우리는 단일 세포에서 APP의 프로세싱을 조사 펄스 추적 실험을 수행 할 수있다. 우리는 APP의 많은 부분이 세포 표면에 나타나는없이 리소좀에 빠른 속도로 이동 한 다음 세 크레타 같은 분열에 의해 리소좀에서 삭제되는 것을 찾을 수 있습니다. 이 기술은 이리저리 세포 내 단백질의 인신 매매 및 처리를 다음과 같은 사항에 대해 paGFP의 유틸리티를 보여줍니다하류 구획 골지을 해요.

일반적인 결과는 βAPP (그리고 그림 1a b)는 TGN를 떠나 빠르게 램프 1 트래픽에 나타납니다 보여줍니다. 광 활성화 기간 동안에, 소체는 리소좀 (도 1B)로 향하는 골지체를 벗어남을 알 수있다. TGN에서 사진 활성화가 동안 억제제 치료를하지 않으면, paGFP 형광은 리소좀에서 볼 수 있습니다. photoactivation을 중지 한 후, βAPP-paGFP 빠르게 (1B에 그림 1a 비교) 리소좀에?...

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Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

세포 표면 단백질의 수송이 비교적 용이하게 검토되고 있지만, 세포 내 단백질의 매매를 시각화하는 것은 더욱 어렵다. 여기서는 광활성 GFP를 통합 구조를 사용하고 정확하게 하류 구획 골지체에서 아밀로이드 전구체 단백질을 따라 그 틈새를 수행하는 방법을 보여준다.

광활성 GFP와 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매 이미징

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.8K 조회수.  Western University.  세포 표면 단백질의 수송이 비교적 용이하게 검토되고 있지만, 세포 내 단백질의 매매를 시각화하는 것은 더욱 어렵다. 여기서는 광활성 GFP를 통합 구조를 사용하고 정확하게 하류 구획 골지체에서 아밀로이드 전구체 단백질을 따라 그 틈새를 수행하는 방법을 보여준다. 

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Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and reactive moieties onto proteins directly in the live cell. Each ncAA is incorporated by a dedicated orthogonal suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) pair that is imported into the host organism. The incorporation efficiency of different ncAAs can greatly differ, and be unsatisfactory in some cases. Orthogonal pairs can be improved by manipulating either the AARS or the tRNA. However, directed evolution of tRNA or AARS using large libraries and dead/alive selection methods are not feasible in mammalian cells. Here, a facile and robust fluorescence-based assay to evaluate the efficiency of orthogonal pairs in mammalian cells is presented. The assay allows screening tens to hundreds of AARS/tRNA variants with a moderate effort and within a reasonable time. Use of this assay to generate new tRNAs that significantly improve the efficiency of the pyrrolysine orthogonal system is described, along with the application of ncAAs to the study of G-protein coupled receptors (GPCRs), which are challenging objects for ncAA mutagenesis. First, by systematically incorporating a photo-crosslinking ncAA throughout the extracellular surface of a receptor, binding sites of different ligands on the intact receptor are mapped directly in the live cell. Second, by incorporating last-generation ncAAs into a GPCR, ultrafast catalyst-free receptor labeling with a fluorescent dye is demonstrated, which exploits bioorthogonal strain-promoted inverse Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) on the live cell. As ncAAs can be generally applied to any protein independently on its size, the method is of general interest for a number of applications. In addition, ncAA incorporation does not require any special equipment and is easily performed in standard biochemistry labs.

A facile fluorescence assay is presented to evaluate the efficiency of amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA pairs incorporating non-canonical amino-acids (ncAAs) into proteins expressed in mammalian cells. The application of ncAAs to study G-protein coupled receptors (GPCRs) is described, including photo-crosslinking mapping of binding sites and bioorthogonal GPCR labeling on live cells.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

연구

화학

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as drug resistance, epithelial-mesenchymal transition (EMT), and metastasis. Intratumoral eATP is 103 to 104 times higher in concentration than in normal tissues. While eATP functions as a messenger to activate purinergic signaling for EMT induction, it is also internalized by cancer cells through upregulated macropinocytosis, a specific type of endocytosis, to perform a wide variety of biological functions. These functions include providing energy to ATP-requiring biochemical reactions, donating phosphate groups during signal transduction, and facilitating or accelerating gene expression as a transcriptional cofactor. ATP is readily available, and its study in cancer and other fields will undoubtedly increase. However, eATP study remains at an early stage, and unresolved questions remain unanswered before the important and versatile activities played by eATP and internalized intracellular ATP can be fully unraveled.
These authors&#39; laboratories&#39; contributions to these early eATP studies include microscopic imaging of non-hydrolysable fluorescent ATP, coupled with high- and low-molecular weight fluorescent dextrans, which serve as macropinocytosis and endocytosis tracers, as well as various endocytosis inhibitors, to monitor and characterize the eATP internalization process. This imaging modality was applied to tumor cell lines and to immunodeficient mice, xenografted with human cancer tumors, to study eATP internalization in vitro and in vivo. This paper describes these in vitro and in vivo protocols, with an emphasis on modifying and finetuning assay conditions so that the macropinocytosis-/endocytosis-mediated eATP internalization assays can be successfully performed in different systems.

We developed a reproducible method to visualize the internalization of nonhydrolyzable fluorescent adenosine triphosphate (ATP), an ATP surrogate, with high cellular resolution. We validated our method using independent in vitro and in vivo assays-human tumor cell lines and immunodeficient mice xenografted with human tumor tissue.

인간 종양 세포 및 종양-xenografted 마우스에 있는 매크로 피노세포증에 의해 중재된 ATP 내재화를 위한 형광 현미경 검사법

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...

암 연구학

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is effective for treating various diseases. Here, we demonstrate light-triggered nuclear translocation of guests using caged molecular glue (CagedGlue-R) tags, whose multiple guanidinium ion (Gu+) pendants are protected by an anionic photocleavable group (butyrate-substituted nitroveratryloxycarbonyl; BANVOC). Guests tagged with CagedGlue-R are taken up into living cells via endocytosis and remain in endosomes. However, upon photoirradiation, CagedGlue-R is converted into uncaged molecular glue (UncagedGlue-R) carrying multiple Gu+ pendants, which facilitates the endosomal escape and subsequent nuclear translocation of the guests. This method is promising for site-selective nuclear-targeting drug delivery, since the tagged guests can migrate into the cytoplasm followed by the cell nucleus only when photoirradiated. CagedGlue-R tags can deliver macromolecular guests such as quantum dots (QDs) as well as small-molecule guests. CagedGlue-R tags can be uncaged with not only UV light but also two-photon near-infrared (NIR) light, which can deeply penetrate into tissue.

This protocol describes light-triggered nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glue tags. This method is promising for site-selective nuclear-targeting drug delivery.

Photoactivatable 태그 갇힌된 분자 접착제를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌 spatiotemporally 제어

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in brain homeostasis, astrocytes supply neurons with vital metabolites and buffer extracellular water, ions, and glutamate. An integral component of the &#8220;tri-partite&#8221; synapse, astrocytes are also critical in the formation, pruning, maintenance, and modulation of synapses. To enable these highly interactive functions, astrocytes communicate among themselves and with other glial cells, neurons, the brain vasculature, and the extracellular environment through a multitude of specialized membrane proteins that include cell adhesion molecules, aquaporins, ion channels, neurotransmitter transporters, and gap junction molecules. To support this dynamic flux, astrocytes, like neurons, rely on tightly coordinated and efficient intracellular transport. Unlike neurons,&#160;where intracellular trafficking has been extensively delineated, microtubule-based transport in astrocytes has been less studied. Nonetheless, exo- and endocytic trafficking of cell membrane proteins and intracellular organelle transport orchestrates astrocytes&#8217; normal biology, and these processes are often affected in disease or in response to injury. Here we present a straightforward protocol to culture high quality murine astrocytes, to fluorescently label astrocytic proteins and organelles of interest, and to record their intracellular transport dynamics using time-lapse confocal microscopy. We also demonstrate how to extract and quantify relevant transport parameters from the acquired movies using available image analysis software (i.e., ImageJ/FIJI) plugins.

Here we describe an in vitro live-imaging method to visualize intracellular transport of organelles and trafficking of plasma membrane proteins in murine astrocytes. This protocol also presents an image analysis methodology to determine cargo transport itineraries and kinetics.

성상 세포에서 세포기관 및 기타 화물의 세포내 운송 시각화 및 분석

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

신경과학

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

Colocalizational 분석에 의한 수용체 후 국제화 인신 매매에 약물 유발의 이동을 추적

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

생물학

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

공 초점 현미경을 사용하여 트랜 인간 배아 신장 세포의 라이브 셀 이미징 및 3D 분석 안지오텐신 수용체의 유형 (1A)의 인신 매매

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Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

<meta charset="utf8"></head><body>Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling 및 Macropinocytosis

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling 및 Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally important for cell function and cell integrity of neurons. Drosophila photoreceptor cells have become a model for studying membrane protein trafficking. Besides rhodopsin, which upon illumination becomes internalized from the photoreceptor membrane and is degraded, the transient receptor potential-like (TRPL) ion channel in Drosophila exhibits a light-dependent translocation between the rhabdomeral photoreceptor membrane (where it is located in the dark) and the photoreceptor cell body (to which it is transported upon illumination). This intracellular transport of TRPL can be studied in a simple and non-invasive way by expressing eGFP-tagged TRPL in photoreceptor cells. The eGFP fluorescence can then be observed either in the deep pseudopupil or by water immersion microscopy. These methods allow detection of fluorescence in the intact eye and are therefore useful for high-throughput assays and genetic screens for Drosophila mutants defective in TRPL translocation. Here, the preparation of flies, the microscopic techniques, as well as quantification methods used to study this light-triggered translocation of TRPL are explained in detail. These methods can be applied also for trafficking studies on other Drosophila photoreceptor proteins, for example, rhodopsin. In addition, by using eGFP-tagged rhabdomeral proteins, these methods can be used to assess the degeneration of photoreceptor cells.

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Here, non-invasive methods are described for localization of photoreceptor membrane proteins and assessment of retinal degeneration in the Drosophila compound eye using eGFP fluorescence.

eGFP 태그 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 밀매를 연구하기

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광활성 GFP와 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매 이미징

요약

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