This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.

1. 전지 도금 및 형질 <ol><li> 세포 배양 후드에서, 플레이트 ~ 300,000 ~ 500,000 SN56 세포 (박사 제인 Rylett의 일종 선물) 35mm의 유리 바닥 공 초점 접시에와 (둘 베코의 수정 이글 배지, DMEM는, 보충 사전 형질 미디어 커버 10 % FBS). </li><li> 증식 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 하룻밤 동안 세포를 배양한다. 참고 : 세포가 약 50 %의 형질 전환 이전에 70 %의 합류해야한다. </li><li> 세포 배양 후드에서, 형광 단백질을 발현하는 플라스미드 트랜 세포는 형광 단백질 여기 구획 표식 (태그 리소좀 관련 막 단백질 1 LAMP1를 태그 TGN 마커 (GALT-CFP 시안 형광 단백질에 결합 갈 락토 실 전이 효소)를 태그 MRFP), 및 paGFP (βAPP-paGFP 태그 관심의 단백질). (이러한 구조는 이전 30 기재되어있다) </li><li> 형질 전환 시약 및 플라스미드 DNA의 F와 세포를 품어또는 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 24 시간. 최적의 균형 세포 독성 및 형질 전환 효율을 형질 에이전트의 5 μL (예를 들어, 리포 펙 타민 2000)에 DNA의 ~ 2 μg의 비율을 사용합니다. 실제 농도는 다른 플라스미드에 최적화 될 필요가있다. 여기에 설명 된 실험에서, 1 μg의 βAPP-paGFP의 / 공 초점 접시, 램프 1-MRFP 0.3 μg의 / 공 초점 요리 및 GALT-CFP의 0.2 μg의 / 공 초점 접시를 사용합니다. 주 : 사용 된 플라스미드의 양은 형질 전환 효율에 의존 할 것이다. </li><li> 신경 세포주 : 단계 1.4 후, 세포 배양 후드에서 미리 형질 매체를 제거하고 1 mM의 24 시간 동안 환상 AMP (dbcAMP)를 dibutyryl 0.1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 ML의 DMEM에 SN56 세포 분화. </li></ol> 2. 현미경 무대 준비 <ol><li> 사전 따뜻한 인산염 완충 식염수 (PBS)와 37 ° C에 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS). imagi 전에 워밍업 현미경 단계37 ° C에 NG. </li><li> 두 번 PBS로 세척 세포는 분화 미디어를 제거하고 37 ℃에서 HBSS 2 ㎖로 교체합니다. 현미경 스테이지에 배치 세포를 37 ℃로 가온. 참고 : 세포가 HBSS 약 1.5 시간 동안 실행 가능한 있습니다. </li><li> 공 초점 판 온도가 현미경 단계와 평형을 5 ~ 10 분을 허용합니다. </li></ol> 골지을 통해 ROI를 3. 사진 활성화 <ol><li> 현미경의 접안 렌즈로, GALT-CFP, 램프 1-MRFP 및 βAPP-paGFP로 형질 세포를 찾을 수 있습니다. <ol><li> 높은 배율 (즉, 63X 또는 100X)와 오일 침지 렌즈를 사용합니다. 형광의 시각적 형태를 들어, 및 로다 민 (MRFP 형광 용) (CFP 및 GFP의 형광을위한) FITC를 시각화 할 수있는 설정 필터를 사용합니다. </li></ol></li><li> 1 μm의 각 채널에 대한 공 촛점 슬라이스를 설정합니다. 저해상도 이미지를 촬영. </li><li> 이미지 작물 관심의 세포. </li><li> 조정 손잡이를 사용하여 수동으로 설정할셀의 중앙에 초점면. 이것은 일반적으로 핵이 가장 큰 셀의 일부분이다. </li><li> TGN (GALT - CFP 형광) 내 (로아) 관심의 3-5 원형 영역을 그립니다. <ol><li> (즉, 자이스 혈구 LSM 프로그램)의 ROI를 그리려면 명령 콘솔에서 &#39;편집 투자 수익 (ROI)&#39;버튼을 선택합니다. </li><li> 원형 투자 수익 (ROI) 버튼을 선택합니다. </li><li> 클릭 GALT - CFP에게 셀의 긍정적 인 영역을 통해 드래그합니다. 참고 : 많은 현미경 사진 표백 패키지는이 기능을 가지고있다. </li></ol></li><li> 중첩 로아와 셀의 이미지를 가져 가라. 나중에 참조 로아의 사본을 저장합니다. <ol><li> 이미지에 ROI를 저장하려면, &#39;매크로&#39;버튼을 선택합니다. </li><li> &#39;CopyRoisToOverlay&#39;(C : /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb 파일 경로)를 시작하는 &#39;로드&#39;버튼을 누릅니다. 참고 : 475-525 나노 미터 (CFP) 대역 통과 (BP), 500-530 nm의 BP (GFP)가 장착 된 공 초점 현미경을,및 560 nm의 긴 패스 (LP) 필터 세트가 필요합니다. 458 nm에서 488 nm의 방출 및 540 nm의 방출에 대한 헬륨 네온 레이저를위한 아르곤 레이저도 필요합니다. </li></ol></li><li> 설정 표백제 시간 코스에 대한 현미경을. <ol><li> 최대 전력 레이저 다이오드 (25 mW의 405 nm의 레이저)를 설정합니다. 주의 : 과도한 사진 활성화가 세포막에 사진 독성 또는 손상이 발생할 수 있습니다. 망막 손상을 방지하기 위해 보안경을 사용하십시오. </li><li> 설정 이미징의 120주기에 대한 현미경을. 주 : 촬상 한 사이클 내에서 ROI를 표백 셀 전체의 촬상 이루어져있다. 이 표백제 시간 코스입니다. </li><li> 모든 이미지 후 20-30 반복 만의 ROI (사진 활성화)을 표백하기 위해 현미경을 설정합니다. 이미지가 달라질 이미지와 표백제까지의 시간. 각주기는 약 30 초, 그래서 이미지 사이의 시간 지연을 설정합니다. 주 : 각 사이클의 촬상 부는 화상의 크기에 따라 약 15 ~ 30 초 걸린다. 각 소유주의 표백나는 약 50 밀리 초입니다. 20 반복에 대한 모든 4 로아의 표백 각 표백제 / 이미지 사이클의 끝에서 4 초를 취할 것입니다. </li></ol></li><li> 표백제 시간 코스를 시작합니다. </li><li> 15 분 (이미징 및 표백의 30주기) 후 표백을 끄고 있지만, 셀의 이미지를 캡처 계속합니다. 참고 : 분 &#39;펄스&#39;기간 인 0-15 시간. </li><li> βAPP-paGFP의 틈새를 따라, (표백)없이 45 분 동안 이미지를 캡처 계속합니다. 참고 : 분 &#39;추적&#39;기간 인 15-45 시간. </li><li> 단계 6에 기재된 분석 방법을 사용하여, 각 채널에 표면함으로써 (여기서, LAMP1-MRFP) 관심 구획이자 (여기서, βAPP-paGFP)의 단백질을 공동 - 지역화. </li></ol> 4. 다운 스트림 구획을 결정 <ol><li> (이 실험에서) 리소좀 최종 구획되어 있는지 확인하려면 단백질이 리소좀에 축적하는 원인이 막 투과성 단백질 분해 효소 억제제를 추가합니다.<ol><li> βAPP를 들어, 0.5 μm의 L685, 458 (특정 γ 크레타 제 억제제) 하룻밤 또는 이미징 전에 30 분 동안 100 μM의 클로로퀸 (deacidifies의 리소좀)를 사용합니다. </li></ol></li><li> 3.8 - 3.1 단계에서와 같이 세포와 photoactivate를 찾을 수 있습니다. </li><li> βAPP-paGFP는 분열의 부재에 축적 경우 이미지 (사진 활성화 제외) 추가 45 분 동안 세포 확인합니다. </li><li> 단계 6에 기재된 방법에 따라 리소좀 (혹은 다른 하류 구획실)로 단백질의 전달 및 후속 간극을 분석한다. </li></ol> 5. 골지 내 사진 활성화의 정확성을 보장 <ol><li> 37 ° C로 예열 HBSS. </li><li> 모든 공 초점 판 HBSS에 66 μm의 nocodazole (처리) 또는 DMSO (제어)으로, 이미징 될 수 있도록, 2 ml의 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 하나의 공 초점 판, 피펫 (2) 37 ° C HBSS ml의 16.60 mM의 nocodazole 재고에서 nocodazole의 7.96 μl를 추가하십시오. </li><li> 제어 그래서lution, 피펫 2 2 ML 튜브에 37 ° C HBSS ㎖의 DMSO의 7.96 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 촬영하기 전에 5 분 동안 nocodazole 또는 DMSO와 HBSS에 세포를 품어. </li><li> 단계 3.1에서와 같이 세포를 찾아보십시오. </li><li> photoactivati​​on 전에 사진 정품 인증 기간 후 Z - 스택을하기 위해 현미경을 준비합니다. <ol><li> &#39;Z 스택&#39;버튼을 클릭합니다. 빠른 XY를 사용하여 스캔을 시작합니다. </li><li> 셀의 상단에 현미경 조절 노브와 초점면을 조정합니다. 눌러 &#39;마크 먼저&#39;스택의 제 1 위치에 설정한다. </li><li> 셀의 하단 현미경 조정 노브 (유리에 가장 가까운)과 초점 평면을 조정한다. 를 눌러 &#39;마크 최근&#39;스택의 마지막 위치를 설정합니다. </li><li> Z 스택 패널에서 &#39;Z 절편&#39;버튼을 누릅니다. 1 μm의 &#39;간격&#39;을 설정합니다. 높은 공간 해상도가 작은 스택 간격을 스택,하지만 더 많은 이미지가 필요합니다 참고 :스택 촬상 기간을 길게 취할. </li></ol></li><li> 단계 3.7에서 3.8 사이에 기술 된 바와 같이, 셀을 표백. 15 분 (30 프레임)로 0 분에서 사진 활성화 및 이미지. </li><li> 30 프레임 후에 영상을 중지합니다. 즉시 비디오의 이미지를 저장합니다. 주의 :이 제 2 이미징 시퀀스를 시작하기 전에 저장되지 않는 경우에는 일부 현미경 먼저 영상을 겹쳐있다. </li><li> 동영상을 저장 한 후, 즉시 단계 5.5에서 매개 변수를 사용하여, Z - 스택을 획득. </li><li> 단계 6에 기재된 바와 같이, CFP-GALT (또는 다른 골지 마커)로 βAPP-paGFP 동시 - 지역화. CFP 빠르게 photobleaches 및 이미징 기간 말까지 표시되지 않을 수 있습니다 참고. colocalization을가 GALT - CFP 가능하지 않을 수 있습니다. colocalization을해야하는 경우, 걸트에 태그를 MRFP를 사용합니다. </li></ol> 6. 소포 필터링 및 colocalization을 <ol><li> 구획의 표면 (예 : 램프 1-MRFP)과 단백질 (을)를 만들기 위해 분석 프로그램 (예를 들어 Imaris)를 사용하여F의 관심 (예 βAPP-paGFP). </li><li> 상단 메뉴 표시 줄에서 능가 버튼을 클릭하여 분석 프로그램의 &#39;능가&#39;​​섹션을 입력합니다. </li><li> 가장 왼쪽 패널 (왼쪽에서 5 번째 버튼)의 상단 표면의 마법사 버튼을 선택합니다. </li><li> 소포 (즉 βAPP-paGFP 형광, 관심의 단백질)를 필터링 할 채널을 선택합니다. </li><li> 다음 마법사와 언론 분야에서 가장 큰 소포의 직경을 제출하여 배경 빼기를 수행합니다. 분석 프로그램이 자동으로 선택 - 관심의 채널 영역 - 필드의 최대 소포로부터 유도 된 임계 값에 기초하여. <ol><li> 수동으로 필요한 경우 선택을 구체화하는 임계 배경을 조정합니다. </li></ol></li><li> 임계 값 선택 화면의 아래쪽에 결합 된 표면을 분리하는 &#39;분할 감동 객체의 옵션을 선택합니다. 참고 : 많은 소포가 밀접로 그룹화하는 경우게델, 한면에서 이러한 개체 분석 프로그램 의지 그룹. <ol><li> 10 ~ 15 대표 소포를 선택하고 평균 소포 직경을 계산하고 마법사에 결과를 입력합니다. </li></ol></li><li> 증가 또는 &#39;품질&#39;(각 스폿의 중앙에 채널의 강도)에 임계 값을 감소시킴으로써 선택된 시드 포인트를 구체화. 주 : 관심있는 채널의 표면이 생성됩니다. 선택면의 추가적인 정련이 시점에서 수행 될 수있다. 각 소포의 화소 수에 기초하여 임계 소체. </li><li> 이 표면과 원래 채널 마스크. 마스크, 표면 생성 마법사 (연필)의 왼쪽에서 4 번째 탭을 선택합니다. </li><li> &#39;모두 마스크&#39;를 선택합니다. 관심있는 소포와 새로운 채널이 생성됩니다. 주 : 마스크 프로세스 동안 원래 채널을 복제하는 옵션이 제공된다. 원래의 데이터가 저장해야하는 경우이 옵션을 선택합니다. </li><li> 반복의필터링되지 않은 채널 (예 : 램프 1 MRFP, 구획) 6.7을 통해 TEPS 6.1. </li><li> 상단 도구 모음에서, colocalization을 도구를 선택합니다. <ol><li> 상단 패널에서 colocalized 할 수있는 채널의 히스토그램 표시로, 최근에 만들어진 마스크​​ 채널을 선택합니다. </li><li> 가능한 모든 데이터를 선택합니다. 때로는 분석 후 존재하는 어두운 픽셀이 있습니다. 히스토그램에서 이러한 픽셀을 선택하지 마십시오, 그들은 결과를 왜곡합니다. </li><li> 오른쪽 패널에서 &#39;Coloc 채널 구축&#39;을 선택합니다. 이것은 단지 colocalized 픽셀을 포함하는 새로운 채널을 생성합니다. 데이터는 &#39;채널 통계&#39;버튼 아래에있는 동일 패널 (Panel)에있을 것입니다. 데이터를 .csv 파일로 내보낼 수 있습니다. </li><li> &#39;재료의 비율이 colocalized&#39;통계를 사용합니다. 이 옵션은 계정에 개체의 픽셀 크기의 강도를합니다. </li></ol></li></ol>

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H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+photolabeling+of+proteins+using+photoactivatable+GFP.">Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP.</a> Methods. 32 (4), 445-450 (2004).</li><li>Hirschberg, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+secretory+protein+traffic+and+characterization+of+golgi+to+plasma+membrane+transport+intermediates+in+living+cells.">Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells.</a> J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).</li><li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER.">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).</li><li>Hailey, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+supply+membranes+for+autophagosome+biogenesis+during+starvation.">Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation.</a> Cell. 141 (4), 656-667 (2010).</li><li>Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Precursor+Protein+is+rapidly+transported+from+the+Golgi+apparatus+to+the+lysosome+and+where+it+is+processed+into+beta-amyloid.">The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid.</a> Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).</li><li>Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+logic+underlying+the+axonal+transport+of+cytosolic+proteins.">Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins.</a> Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).</li><li>Herl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+amyloid+precursor+protein+affect+its+interactions+with+presenilin/gamma-secretase.">Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase.</a> Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).</li><li>Lorenzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Direct+Transport+of+Cell+Surface+APP+to+the+Lysosome+defines+a+novel+selective+pathway.">Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway.</a> Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).</li><li>Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+'Swedish'+amyloid+precursor+protein+variant+in+neuro2a+(N2a)+cells.+Evidence+that+cleavage+at+the+beta-secretase";site+occurs+in+the+golgi+apparatus.">Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus.</a> J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).</li><li>Thinakaran, G., Koo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+Precursor+Protein+Trafficking,+Processing,+and+Function.">Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).</li><li>Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Activation+and+Excitation+Properties+of+PA-GFP+in+the+720-920-nm+Region.">Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region.</a> Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).</li><li>Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+export+of+the+vesicular+stomatitis+virus+G+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+requires+a+signal+in+the+cytoplasmic+tail+that+includes+both+tyrosine-based+and+di-acidic.">Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic.</a> 11 (1), 13-22 (2000).</li><li>Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+products+of+amyloid-beta+precursor+protein+are+sorted+to+distinct+carrier+vesicles+that+are+independently+transported+within+neurites.">The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites.</a> J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계 나 이해 관계의 충돌이 없습니다.

이러한 기술은 후속 매매 및 분열을 시각화 TGN에 paGFP 태그 막 단백질의 정확한 광 활성화를 설명한다. paGFP 25 일 전 십 년간 생성 된 반면,이 하류 구획에 초기 단백질의 인신 매매를 수행하는 정확한 사진 활성화의 첫 번째 예입니다. APP-paGFP를 사용하여 이전의 연구 사진을 활성화 골지 (11)로 간주 된 세포의 요정 핵 영역을 구성한다. 그러나, 우리의 현미경 사진, 리소좀, 초기 엔?...

알츠하이머 병 (AD)의 특징은 노인성 플라크와 뇌의 신경 섬유 엉킴 (NFTS)의 존재이다. 노인성 플라크의 주성분은 β - 아밀로이드 (Aβ)입니다. Aβ는 그 전구체에서 파생 된; 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 1. 응용 프로그램의 아밀로이드 분열은 β-크레타 제 2에 의해 APP에서 ectodomain의 제거를 시작합니다. 남은 잔류 물을 99 카복실 말단 단편 (CTF)는 Aβ 3-7을 생산하는 γ 세 크레타 제에 의해 절단 될 수있다. 많은 실험 엔도 솜 / 리소좀 시스템으로 세포 표면에서 내재화 후 세포 표면 APP의 분열을 설명하고 있지만, 최근 다수의 연구는 APP의 세포 트래 피킹 또한 그 처리 8-11을 조절하는데 중요하다는 것을 제안 하였다. γ 크레타 제 저해제 및 아밀로이드 베타 immun으로 Aβ의 수준을 조절에서 시도의 숫자가 있었다otherapies. 그러나, 이들 치료법에 대한 최근의 임상 시험은 경우에 피해를 야기 12, 더 유익 없었다하고. 아밀로이드 베타의 생산을 조절하는 개발되지 않은 전략은 APP의 하위 세포 현지화 및 γ-크레타 제의 상호 작용을 변경하는 것입니다. 골지, 세포막, 그리고 엔도 좀 / 리소좀은 모든 APP의 γ-절단 가능한 로케일로 제안되었다. 우리의 실험실에서 연구 APP 및 γ-크레타 제는 리소좀 막 (13)의 거주자 단백질이 있음을 시사한다. 또한, 우리는 리소좀 γ 크레타 제는 산성 최적의 pH (13)를 가지고 있음을 발견했다. 또한, 클로로퀸 또는 NH 4 CL와 엔도 솜 / 리소좀 시스템의 알칼리화, Aβ (14)의 생성을 감소하는 것으로 나타났다. -γ 크레타 제 억제 또는 녹아웃 또는 프레는 리소좀 15-17에서 APP-CTFs 축적으로 이어집니다. 또한, 응용 프로그램 엔도 시토 시스를 방해하는 Aβ 생산 18 ~ 20을 낮 춥니 다. 초기 단백질과 엔도 솜 / 리소좀 시스템에서 재활용 단백질 정렬 역으로 골지의 중요성에도 불구하고, 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매는 세부 (21)에 연구되지 않았다. 최근 작품은 앱이 retromer 단지와의 상호 작용을 통해 트랜스 골지 네트워크 (TGN)로 재순환 될 수 있음을 보여 주었다. retromer 단지의 다운 규제는 Aβ 생산 8,22-24을 감소시킨다. 그러나, 골지에서 응용 프로그램의 출구는 잘 연구되지 ​​않았다. 이러한 트랜스페린 수용체로 세포 표면 단백질의 세포 내 이입을 다음 있지만, 쉽게 표시 및 준수, 세포 내 단백질의 인신 매매를 따라하는 것은 더 어렵습니다. 사실, 몇 가지 단백질은 세포 내 인신 매매는 몇 군데 있었다. 이러한 사진 기동-GFP (paGFP), 형광 단백질 태그의 출현은 세포 내 인신 매매를 조사하기위한 새로운 도구를 제공하고 있습니다. 사진 - 기동-GFP는 GF의 한 형태이다합성 후 거의 보이지이지만, 413 nm의 레이저 광에 의해 활성화 된 후에 강한 녹색 (GFP)의 형광을 개발하고이 신호 (25, 26) 일 동안 안정하다 P. paGFP를 사용 제물 리소좀 단백질 intralysosomal 매매를 입증하는 데 사용 된 막 단백질 1 (LAMP1) (25), 소낭 구내염 바이러스 당 단백질 (VSVG, 분비 경로의 마커) (27)의 세포 표면에 전달하고, 퍼 옥시 솜의 회전율 28 및 29 autophagosomes. 생균에 TGN에서 APP의 정렬을 가시화하기 위해, 우리는 C 말단에 광 활성화 가능한 (paGFP)에 결합 APP의 마지막 112 아미노산을 발현하는 플라스미드를 설계 (30) (βAPP-paGFP라고 함). 우리는 또한 전체 길이 응용 프로그램과 함께 이러한 실험을 수행하고 비슷한 결과를 달성했다; 그것은 밝은 이미지를 제공하기 때문에 ΒAPP 구조가 여기에 사용됩니다. 우리는 다음 사진을 활성화 &amp;# 946;에만 TGN에서 APP-paGFP, TGN 마커 갈 락토 (GALT)에 의해 경계가있다. 앱이 핵 주변 지역에서 빠른 축삭 앱의 운송 및 통관을 시각화 paGFP 태그되었지만,이 하나 신중하게 정의 함에서 다른 11,31,32에 응용 프로그램 매매의 첫 번째 데모입니다. 여기서 우리는 정확한 TGN 내 사진 활성화 및 다운 스트림 구획과 리소좀 (30) 후속 절단 및 통관에 응용 프로그램의 출구를 보여줍니다. 골지 내의 정확한 광 - 활성화 단백질은 다른 시스템에 널리 적용 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom culture dishes&#160;</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P-35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibutyrl cyclic AMP</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat in activated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Microscopy stage insert P</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempcontrol 37&#8211;2 digital 2-channel</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 63&#215; 1.4 numerical aperture oil immersion lens&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L685, 458&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565771</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholorquine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628&#160;</td>
			<td>dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>with colocalization package&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging the intracellular trafficking of app with photoactivatable gfp

베타 아밀로이드 (Aβ)는 알츠하이머 병 환자의 뇌에서 발견 노인반의 주요 구성 성분이다. Aβ는 β 및 γ - 세 크레타에 의해 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 순차적 분열에서 파생됩니다. AD 병리에 Aβ의 중요성에도 불구하고, 이러한 분열의 세포 내 현지화가 잘 확립되어 있지 않습니다. 우리 실험실에서 직장 및 다른 세포 표면에서 내재화 후 APP 처리에 엔도 솜 / 리소좀 시스템 연루. 그러나, 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매는 상대적으로 파악 하였다입니다. 세포 표면 단백질은 많은 라벨링 기술에 수정할 수있는 반면, 골지체에서 막 단백질의 거래를위한 다음의 간단한 방법은 없다. 이를 위해, 우리는 C- 말단에서 사진 기동 GFP (paGFP)로 태그 한 응용 프로그램 구조를 만들었습니다. 합성 후 paGFP 낮은 기저 형광을​​ 가지고 있지만 413 nm의 빛을 t로 자극 될 수있다O 강한, 안정적인 녹색 형광을 생산하고 있습니다. 사용하여 골지 마커 락토 트랜스퍼 대상 시안 형광 단백질 (GALT-CFP)에 결합 된, 우리는 트랜스 골지 네트워크 APP photoactivate 정확하게 할 수있다. 이 형광 식별 하류 구획 (트래픽) 초기 엔도 좀 (Rab5), 후반 엔도 좀 (Rab9)와 리소좀 (램프 1)에 대한 구획 마커 단백질 태그로 사진 활성화 APP-paGFP은 다음에 할 수 있습니다. 또한, 클로로퀸 또는 γ 세 크레타 제 억제제 인 L685, 458을 포함 APP 처리에 억제제를 사용하여, 우리는 단일 세포에서 APP의 프로세싱을 조사 펄스 추적 실험을 수행 할 수있다. 우리는 APP의 많은 부분이 세포 표면에 나타나는없이 리소좀에 빠른 속도로 이동 한 다음 세 크레타 같은 분열에 의해 리소좀에서 삭제되는 것을 찾을 수 있습니다. 이 기술은 이리저리 세포 내 단백질의 인신 매매 및 처리를 다음과 같은 사항에 대해 paGFP의 유틸리티를 보여줍니다하류 구획 골지을 해요.

일반적인 결과는 βAPP (그리고 그림 1a b)는 TGN를 떠나 빠르게 램프 1 트래픽에 나타납니다 보여줍니다. 광 활성화 기간 동안에, 소체는 리소좀 (도 1B)로 향하는 골지체를 벗어남을 알 수있다. TGN에서 사진 활성화가 동안 억제제 치료를하지 않으면, paGFP 형광은 리소좀에서 볼 수 있습니다. photoactivation을 중지 한 후, βAPP-paGFP 빠르게 (1B에 그림 1a 비교) 리소좀에?...

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Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

세포 표면 단백질의 수송이 비교적 용이하게 검토되고 있지만, 세포 내 단백질의 매매를 시각화하는 것은 더욱 어렵다. 여기서는 광활성 GFP를 통합 구조를 사용하고 정확하게 하류 구획 골지체에서 아밀로이드 전구체 단백질을 따라 그 틈새를 수행하는 방법을 보여준다.

광활성 GFP와 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매 이미징

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

imaging-the-intracellular-trafficking-of-app-with-photoactivatable-gfp

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K 조회수.  Western University.  세포 표면 단백질의 수송이 비교적 용이하게 검토되고 있지만, 세포 내 단백질의 매매를 시각화하는 것은 더욱 어렵다. 여기서는 광활성 GFP를 통합 구조를 사용하고 정확하게 하류 구획 골지체에서 아밀로이드 전구체 단백질을 따라 그 틈새를 수행하는 방법을 보여준다. 

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Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

이런 산화물로 hESCs과 hMSCs을 라벨링하는 MR 영상과 생체내 추적 비침습에 대한 Nanoparticles

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

연구

생물학

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

FDG micro-PET/CT와 마우스의 브라운 지방의 기능 영상

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

모자이크 성인의 라이브 이미징 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 광 수용체 (photoreceptor)

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

빠른 합성 및 GFP 기반 기자들과 화학적으로 활성화 된 전사 인자의 상영

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.