저자는 기술 개발과 훈련의 지원을 위해 빌 &amp; 멜린다 게이츠 재단 감사합니다.

주 :이 프로토콜은 96 웰 플레이트, 8 튜브 스트립, 모세관 기반 시스템 (10 μL의 반응 부피)에 대한 양 및 농도를 포함한다; 그러나, HRM은 대응하는 모든 볼륨을 스케일링하여 5 μL의 반응 부피로 384 웰 플레이트 기반 시스템에서 수행 될 수있다. 대부분의 시스템에 대한 검색의 범위는 10 NG의 주형 DNA에 10 페이지입니다. 1. 템플릿을 준비 <ol><li> 혈액 필드 사이트 연구에 참여하는 환자에서 얻은 전체 혈액 저장, 펠렛 적혈구, 또는 필터 종이에 직접 말라리아 원충 샘플을 얻습니다. 참고 : 시료는 문화 적응 체외에서 성장을 할 수있다; 분석에 대한 몇 가지 표준 실험실 균주가 말라리아 연구 및 참조 시약 리소스 센터 (MR4에서 주문할 수 있습니다, 샘플 펠렛 적혈구 나 문화에서 직접 사용할 또는 전혈, 적혈구, 또는 여과지에서 추출 할 수있다. </li><li> DNA 추출여과지 또는 문화 적응 균주 참고 : HRM 소금 농도에 민감하다; 인해 가변 추출 방법에 농도 차이가 유의 용융 온도에 영향을 줄 수있다. 특정 최종 버퍼가 성공을위한 중요한 요소는 없지만, 표준 공통의 용출 또는 부유 버퍼 (즉, 물, 1X 테 [ &#39;낮은 테&#39;또는 &#39;DNA 서스펜션 버퍼&#39;: 10 mM 트리스 - CL, 0.10 mM의 EDTA]를 사용하거나 1X TE [10 mM 트리스 - CL, 1 mM의 EDTA]) 모든 샘플이 변칙 또는 일치하지 않는 용융 곡선을 방지하기 위해. <ol><li> 의 템플릿 희석을 준비 10 페이지 -10 NG 당 μL 표준 테, TE, 또는 물을 각각 10 μL 반응. </li></ol></li><li> 펠렛 적혈구에서 직접 증폭 <ol><li> 얇은 스미어 현미경을 사용하여 적혈구를 결정 기생충 참고 : 감염된 적혈구의 기생충을 결정하는 방법은 질병 통제 예방 센터 (CDC)에서 사용할 수 있습니다 : HTTP :<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li> 0.5 % 1 위 parasitemias을 희석 : (400) PCR 등급 물, TE, 또는 테에서. 각 5 10 μL 반응에 3 μl를 사용합니다. </li></ol></li><li> 통제 수단 주 : HRM은 시퀀스 인구 (12)에 변형 검출 유전자 검사에 이용 될 수있다; 그러나, 정확한 유전자형은 표준 순서 검증 된 SNP를 포함하는이 심문이 필요합니다. 알려진 유전자형이 사용할 수있는 플라스미드 구조 또는 말라리아 분리합니다. 대부분의 애플리케이션의 경우, 3D7 (MRA MR4-151) 야생형 대조군으로 사용된다. 때문에 간 실행 변동성에 항상 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 포함한다. <ol><li> 긍정적 인 컨트롤 : - 시퀀스 확인 SNP 유전자형과 1 μL 플라스미드의 희석 또는 표준 당 10 ng의 10 페이지를 준비합니다. </li><li> 증폭 반응에 대한 노 템플릿 컨트롤 (NTC)으로 사용 된 PCR 등급 물 : 음성 제어 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. PCR 증폭 <ol><li> 반응 혼합물을 준비 <ol><li> (선택 사항) 미네랄 오일 오버레이. 참고 : 일부 HRM 시스템은 플랫폼 독립 용융하고 증폭 동안 축합 생성물 및 증발을 방지하기 위해 가열 된 뚜껑이 없다. <ol><li> 반응 혼합물을로드하기 전에, 각 웰 플레이트에 20 μL 광 광유를 추가한다. </li></ol></li><li> 모든 분석의 10 배 작업 주식을 준비 <ol><li> 추천 10 배 근무하는 농도뿐만 아니라 차단 프로브 기반 HRM의 유전자형에 대한 최종 농도는 표 1을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 반응 혼합물을 준비 <ol><li> 웰 플레이트 또는 튜브의 각에, 앞으로 주식을 작업 1 μL 10 배 추가하고 프라이머 및 프로브, 4.0 역 - 10 μL 총 반응 부피 5.0 μL의 2.5 배 또는 2.0 배의 인사 마스터 믹스, 1 μL 템플릿 및 PCR 등급 물 . </li></ol></li><li> 커버 플레이트 또는 튜브 <ol><li> 광학 플레이트의 사용모세관 기반 시스템 용 플레이트 기반 증폭을위한 평가 보증 등급 (EAL), 스트립 튜브 기반 시스템 용 광학 캡, 플라스틱 캡. 수 있는지 범위는 완료되고 접시와 뚜껑을 완전히 밀봉 증폭 동안 증발을 방지하기 위해 고정된다. </li></ol></li><li> 스핀 샘플 <ol><li> 스핀 플레이트 1,800 XG에서 3 분, 기포를 제거하기 위해 미네랄 오일이 사용된다면 오일 및 수성 상을 분리. </li></ol></li></ol></li><li> 증폭 프로토콜 <ol><li> 열 자전거 타는 사람에 반응 플레이트 또는 튜브를 놓습니다. 실행 표준 차단 프로브 또는 MAAB 증폭 프로토콜 (표 각각 2, 3). 이들 방법 간의 어닐링 온도에서 차이가 있음에 유의해야한다. </li></ol></li></ol> 3. HRM 분석 <ol><li> 용해 <ol><li> PCR 증폭 한 후, 분석 녹는를 진행합니다. 내장이없는 증폭 독립 용융 시스템 (예., BioFire 국방 LightScanner 시스템)의 경우, 재HRM 상품에 열 자전거 타는 사람과 장소에서 증폭 판을 이동합니다. 두 프로브 및 앰플 리콘 용융 피크를 생성하기 위해 80 °의 C - 시스템 소프트웨어 인터페이스에서, 플레이트 (40)로부터 용융. 주 : 용융 및 분석 시간을 절약하기 위해, 용융 창이 단지 프로브 또는 앰플 리콘 용융 영역을위한 온도 범위를 커버하도록 단축 될 수있다. 필요하고 -20 ° C 또는 4 ℃에서 보관하는 경우 용해 후, 플레이트 및 튜브 재 용융 될 수있다. 만 4 ℃에서 보관 유리 튜브는 균열에서 튜브를 방지합니다. </li></ol></li><li> 용융 분석 <ol><li> 음의 샘플을 제거 <ol><li> 분석 소프트웨어 내에서 증폭 또는 그 들쭉날쭉 용융 피크를하지 않았다 추가 분석 샘플에서 제거합니다. 참고 : 각각의 실행 파일에 대한 분석의 모드를 선택한 후, 기기가 자동으로 그룹 양극과 음극 샘플을. 각각의 서브 세트를 유전형 전에 사용자가 수동으로 호출을 변경할 수있다. <ol><li> 하나 녹는에서곡선 또는 용융 피크 뷰, 곡선을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 선택을 제거합니다. 잘못 분류 샘플을 선택한 후, &quot;새 통화&quot;해당 그룹을 선택하고 클릭으로 이동 &quot;변경을 적용합니다.&quot; </li></ol></li></ol></li><li> 정규화 <ol><li> 온도 (-df / DT) ( &#39;차이 곡선&#39;)보기에 대한 정규화 된 형광의 부정적인 유도체에서 지역 용융 프로브를 둘러싸 정상화 막대를 이동합니다. 주 : 프로브 영역이 두 영역의 융점보다 낮은 온도, 용융. 정규화 바는 용융 피크의베이스에 있어야합니다. </li></ol></li><li> 그룹을 계산 <ol><li> 정상화 후 선택 &#39;계산 그룹&#39;가 자동으로 그룹에 샘플을 할당합니다. 필요한 경우, 수동으로 특정 그룹에 샘플을 다시 할당. 참고 : 일부 분석 소프트웨어가 변경 될 수없는 고감도 임계 값을 가지고; 이러한 경우에, Software 시각적으로 다른에 속하는 다른 그룹에 샘플을 할당 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 유전자형 지정 <ol><li> 표준 (양성 대조군)에 따라 각 그룹에 대한 유전자형을 할당합니다. <ol><li> (그 정확한 변경 사항이 잘못 분류 샘플을 선택하고 &quot;새 통화&quot;옆에있는 드롭 박스에서 오른쪽 그룹을 선택하여 그룹화 탭에서 만든되지 않은 경우) 사용자가 계산 된 그룹이 올바른지 확인 후, &quot;편집 그룹 이름을 선택 그룹화 &quot;탭&quot;에서 &quot;. </li><li> 컬러 박스에 대응하는 표준의 유전자형을 시작 (3d7 표준은 공지 된 유전자형을 갖고 적색 그룹에있는 경우, 예를 들면, 붉은 기 유전자형을 갖는다). 를 눌러 &quot;OK&quot;를하고 결과를 저장합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 수출 결과 <ol><li> 수출 유전자형 추가 샘플 인구 분석을 위해 스프레드 시트로 호출합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).</li><li>Hayton, K., Su, X. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum.">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li><li>Neafsey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+genotyping+highlights+the+role+of+natural+selection+in+Plasmodium+falciparum+population+divergence.">Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence.</a> Genome biology. 9 (12), R171 (2008).</li><li>Volkman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+diversity+in+Plasmodium+falciparum.">A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum.</a> Nature. 39 (1), 113-119 (2007).</li><li>Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+genomics+and+genome+biology+to+understand+malaria+biology.">Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).</li><li>Manske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum+diversity+in+natural+infections+by+deep+sequencing.">Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing.</a> Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).</li><li>Auburn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+within-host+Plasmodium+falciparum+diversity+using+next-generation+sequence+data.">Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+SNP-based+molecular+barcode+for+Plasmodium+falciparum+identification+and+tracking.">A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking.</a> Malaria Journal. 7, 223 (2008).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+surveillance+detects+both+clonal+and+epidemic+transmission+of+malaria+following+enhanced+intervention+in+Senegal.">Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal.</a> PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).</li><li>Daniels, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=field-deployable+method+for+genotyping+and+discovery+of+single-nucleotide+polymorphisms+associated+with+drug+resistance+in+Plasmodium+falciparum.">field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).</li><li>Olbadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+outbreak+of+Plasmodium+falciparum+in+eastern+Panama.">Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama.</a> The Journal of infectious diseases. , (2014).</li><li>Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis.">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li><li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia.">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89 (2014).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

지속적인 HRM은 post-PCR 분석 단계; 따라서, 샘플 분석 셋업에서 전환을 추적하는 데 사용되는 형광 삽입 성 염료의 추가 도입으로, 표준 PCR 프로토콜과 유사한 이중 가닥 고해상도 용융 단계에서 단일 - 가닥 DNA에 관한 것이다. 성공적인 HRM 분석을위한 가장 중요한 인자는 강력한 PCR 생성물이다. 분석 설계 핵심이며, HRM 분석 설계에 최적화 된 여러 가지 도구는 상업적으로 온라인 13 사용할 수 있습니다. ~ 20 염기쌍을 동반 80-150 염기쌍의 증폭 길이는 프로브의 영역 내에서의 SNP뿐만 아니라 여러 개의 SNP의 일배 체형을 구분하기 위해 SNP 또는이자 작업 최선의 SNP를 위에 중심 프로브를 차단했습니다. 프로브는 3 &#39;C3의 스페이서 또는 3에서 2 염기쌍 미스 매치&#39;증폭을 방지하는 동안 연장 단부를 사용하여 차단 될 수있다. 프로브 또는 왓슨 크릭 주형 가닥과 일치하도록 설계 될 수있다; 선택허용되는 용융 피크를 생산하는 프로브 디자인을 결정하는 실제 테스트에 따라 달라집니다. 순방향 또는 역방향 프라이머 과량은 차단 프로브 어닐링 본쇄 증폭 산물을 생성하기 위하여 사용된다. 프로브는 순방향 가닥 서열을 포함한다면, 그 후, 프라이머는 과량으로 사용되는 역방향 통상 1 : 5 비율 및 역방향 가닥 일치 프로브 반대로. 마찬가지로, HRM은 충분하고 강력한 PCR 제품과 가장 잘 작동합니다. PCR 반응 최적화는 최적의 어닐링 온도를 결정하기 위해 구배 PCR 및 아가 로스 겔 또는 Bioanalyzer 분석을 요구한다. 주형 농도는 이러한 사전 증폭, 주형 (13)의 농도를 증가시키기 위해 낮은 프라이머 농도와 순환 수를 사용하는 모든 대상 바이어스 다중화 증폭 등의 방법을 사용하여 증가 될 수있다. 악기의 소수에 불과 MAAB와 호환됩니다. 유리 모세관 튜브의 열 특성 내가 사용N이 시스템은이 방법을 용이하게한다. 모세관의 작은 내부 직경뿐만 아니라 유리를 통해 신속한 열전달 플라스틱의 단열 특성에 기인 어닐링 변성 사이클 사이의 느린 변화 속도를 갖는 표준 PCR의 plasticware,보다 엄격한 온도 제어를 제공한다. 이 방법의 검출 감도는 야생형 및 돌연변이 체 대립 유전자 (10)의 혼합물에 돌연변이 대립 유전자의 1 % 미만 2-5% 감소 될 수있다. 인사는 암 유전자 변이에 대한 검사에 전염병 감시의 설정과 수많은 다양한 애플리케이션에서의 SNP 유전자형을위한, 손쉬운 효율적이며 경제적 인 도구입니다. 이러한 나노 로슈의 LightCycler 및 시스템 (480, 96)뿐만 아니라, 표준 증폭, 실시간, 및 복사 횟수 기능에 더하여 에코 실시간 PCR 시스템 제공 HRM 여러 다른 악기. 높은 처리량 기계를 사용하여, HRM의 바코드는 비용 레모든 시약 및 소모품을 포함하여 우리의 손에 분석 당 $ 0.50,보다의. 여기에 기술 된 상황에서, 필드 기반 애플리케이션 저감 인구 다이버 수입 기​​생충 종류의 검출, 감소 된 약물 감수성과 관련된 된 SNP 외관 및 확산을 포함하여 말라리아 관리 노력과 관련된 변화를 실시간 인구 감시를 허용한다. 방법에 대한 상세 검색은 말라리아 제거 및 근절을 향한 진행 상황을 알리기위한 유용한 추가 감도를 제공합니다.

말라리아 제어 및 근절에 대한 새로운 관심에도 불구하고, 말라리아는 거의 감염의 위험에 세계 인구의 절반 매년 550,000 명 이상의 사망자, 사하라 사막 이남의 아프리카 (1) 특히 아이들과 함께, 전 세계적으로 부담이 남아있다. 이러한 새로운 제어 및 박멸 프로그램은 감소 된 약물 감수성과 관련된 돌연변이 염기 서열 분석 말라리아 기생충 다수 증가 병독성과, 게놈 르네상스 지원 및 인구 특성 2,3- 용되었다. 단일 염기 다형성 (SNP가)는 가장 일반적으로 확인 된 유전자 변형 4-7 중입니다. 휴대용 SNP 지노 타이핑 방법은 현장에서 실시간 감시 및 인구 8 추적 제공. 개별 기생충 지문 이외에, &#39;분자 바코드&#39;또한 대립 유전자 빈도에서 극적인 시간적 변화를 검출하기 위해 사용되는뿐만 아니라 분산 효과적인 인구의 크기와 감염 9의 복잡성. 정보의 SNP의이 세트는 쉽게 많은 유전자형 플랫폼에 적응하는 동안, 높은 해상도 (HRM)를 분석에 특히 민감하고 간단한 조작과 낮은 비용으로 새로운 돌연변이 검출 시퀀싱 및 다른 비교 연구를 기반 분야에 매우 적합하다 용융 접근 방식은 자원이 부족한 설정에서 매력적이다. HRM는 형광 염료를 포함하고 표준 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR)으로 시작한다. 이후의 PCR 분석은 용융 피크의 amplicon 용융 온도를 결정한다; 짧은 앰플 리콘의 단일 SNP 차이는 실질적인 융해 피크 온도 (Tm)의 차이가 발생할 수있다. 이 방법에 대한 몇 가지 개선은 (현재의 여러 대립 유전자와 샘플 polyg을 작은 돌연변이 대립 유전자를 클래스 IV (AT)의 SNP를 포함하여 SNP를 차별화하고, 감지하는 더 나은 유전자형 해상도를 제공enomic 감염). 먼저, 분석은 전달 및 상이한 농도로 존재 역방향 프라이머 외에 SNP 영역 위에 중심 짧은 프로브를 포함. 이 차단 된 프로브로 인해 프로브 템플릿 제품의 생산을 증가 비대칭 프라이머 농도에 PCR 증폭하는 동안, 그러나 과잉 생산 가닥에 결합되지 않습니다. 초과 템플릿 가닥에 결합 된 프로브로 구성이 분리 된 이중 가닥 증폭은 ~ 20-30 BP 있습니다; 자신은 크게 10 불일치 하나 또는 여러 개의 기본 프로브 템플릿과 관련된 훨씬 더 큰 Tm은 차이에 전체의 증폭 (80-150 BP) 납에 비해 길이를 감소. 둘째, 돌연변이 대립 유전자 증폭 바이어스 (MAAB)는 바이어스에 polygenomic 감염 낮은 비율에 존재하는 돌연변이 대립 유전자를 향해 반응을 반응 어닐링 온도를 낮춘다. 어닐링 온도는 완벽 매치 (야생형)의 TMS 및 부정합 (돌연변이) 탐침간에 설정된에스. 이 온도에서, 야생형 대립 유전자의 바인딩은 증폭 따라서 모두 단일 샘플 (10)에 존재하는 돌연변이 대립 유전자 증폭을 향해 편향 그 불일치 당량에 비해 방해 충분히 안정적이다. 이러한 인사 관리 개선으로,이 기술은 현재보다 1에서 유행 남미 (11)의 감염과 새로운 돌연변이 검출 순서에서 서로 바로 옆에있는 여러 개의 SNP의 분화, 돌연변이와 관련된 기생충의 기원 추적 및 신원을 허용했다 polygenomic 샘플 (10)의 대립 유전자의 %. 증가 된 감도는 사전 제거 상태 및 약물 내성 신흥 위험이있는 사람들을 접근 지역에서 특히 중요하다. 빠르고 쉽게 구내 감도 저하와 관련된 수입 기​​생충의 SNP를 식별하는 능력이 감시 활동 및 제어 프로그램에 관한 알린다자신의 구현 증가 말라리아 퇴치 및 제거 노력을 식별 핫스팟의 효과. 이 프로토콜은의 방법에 대해 설명 차단 프로브를 기반 MAAB에 대한 증가 인사의 유전자형 감도.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LightScanner Master Mix</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>HRLS-ASY-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td>for BioFire Defense plate-based HRM systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0221</td>
			<td>TE buffer with reduced EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmodium falciparum standards</td>
			<td>MR4</td>
			<td>MRA-151, 156, 205, 330</td>
			<td>MR4.org offers free genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Scanner Primer Design Software</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td></td>
			<td>commercial sofware for HRM assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4909631001</td>
			<td>For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938A</td>
			<td>Agilent 2100 bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 2.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3531414001</td>
			<td>Capillary-based system for MAAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Nano</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6407773001</td>
			<td>Strip tube-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>Strip-tube and plate-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-96</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0011</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-384</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0001</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightCycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729749001</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightCycler)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-9665&#160;</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-3865&#160;</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 8-Tube Strips (clear)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6327672001</td>
			<td>strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4929292001</td>
			<td>capillaries for HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical plate seals</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td>other brands also work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria

박멸의 수십에도 불구하고, 말라리아는 글로벌 부담이 남아있다. 지역 제거 및 글로벌 박멸에 최근 새롭게 관심은 항 말라리아 약물로 감소 감수성과 관련된 지리적 인구의 특성뿐만 아니라 변화를 포함하여 말라리아에 대한 책임 말라리아 기생충 종에 대한 증가 게놈 정보를 수반하고있다. 하나의 일반적인 유전 적 변이, 단일 염기 다형성 (SNP가)는 기생충 유전자형을위한 매력적인 목표를 제공합니다. 이 마커는 약물 내성 마커를 추적뿐만 아니라하지 약물 또는 다른 선택적 압력에서 마커를 사용하여 기생충 인구를 추적뿐만 아니라 유용하다. SNP 지노 타이핑 방법은 약제 내성을 추적 할뿐만 아니라, 특히 eliminat 가까워 영역에서 말라리아 관리 노력에 응답하여, 인구 감시 개별 기생충 지문 할 수있는 능력을 제공한다이온 상태. 정보의 SNP 특정 유전자형 기술에 얽매이다가 발견되었지만, 고해상도 용융 (HRM) 분석에 필드 기반의 연구에 특히 적합하다. 하나의 표지 된 프로브의 개별의 SNP를 필요 복수 게놈 (polygenomic)가 포함되어 샘플의 SNP를 검출하기 위해 기껏​​해야 10 %의 민감도를 제공하는 표준 형광 프로브 기반 방법에 비해, HRM 2-5 %의 감도를 제공한다. 이러한 차단 프로브 및 비대칭 프라이머 농도뿐만 아니라 사소한 대립 유전자의 증폭으로 바이어스 PCR로 증폭 어닐링 온도의 최적화 등의 인사에 대한 수정은 더 HRM의 감도를 향상시킬 수 있습니다. 감도 향상 특정 분석에 의존하지만, 우리는 마이너 대립 유전자의 1 % 미만으로 검출 감도를 증가했다. 말라리아 박멸에 접근 지역에서 신흥 또는 수입 약제 내성의 조기 발견 홍보에 필수적이다ompt 응답. 마찬가지로 polygenomic 감염을 감지하고 애매한 로컬 저장소에서 가져온 기생충 유형을 구별하는 능력은 제어 프로그램을 알릴 수있다. 이 원고는 또한 환자 샘플에서 polygenomic 감염을 확인하기 위해 감도를 증가 고해상도 용융 기술에 대한 수정 사항을 설명합니다.

데이터 분석 소프트웨어 및 장비에 따라 여러 가지 방법으로 시각화 될 수있다. 전형적으로, 온도 결과에 대해 온도 (-df / DT)에 대해 정규화 된 형광 마이너스 유도체의 플롯은 용융 피크를 가시화하고 유전자형을 결정하는 가장 간단하다. 전체 용융 창 (40 ° C-80 ° C). 양쪽 앰플 리콘과 용융 프로브 영역 초래 한 두 영역에 대한 정규화 용융 피크의 일 예를 나타낸다 것이다. 특정 SNP에 대응 피크의 명확한 분화 단지 프로브 영역 결과 분석 윈도우를 설정 (도 2). 프로브 기반의 분석은 명확하게 동형 접합 SNP 피크 (그림 3)과 일치 용융 온도와 각 피크로 두 대립 유전자의 존재를 보여줍니다. 그림 4는 progressi를 보여줍니다vely 혼합 대립 유전자 (도 4b)의 집단에서 돌연변이 대립 유전자에 대한 감도 증가의 결과로, 돌연변이 체 대립 유전자 (좌측 피크) (도 4a)을 향해 바이어스 증폭 (MAAB) 결과 중 어닐링 온도를 감소시킨다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> 분석 될 수있는 두 프로브 (저온)에서 넓은 용융 결과 창을 통해 온도에 대해 정규화 된 형광의 음 도함수 플롯도 1 프로브 및 앰플 리콘 용융 영역. 앰플 리콘과 용융 피크. (. 다니엘스 등 DOI에서 적응 : 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> SNP 불일치 (회색) 낮은 용융 온도를하면서 그림 2. 프로브 용융 피크. 완벽한 일치 (일반적으로 야생 형 대립 유전자가), 높은 용융 피크 (적색) 결과. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> 두 대립 유전자는 샘플에 존재하는 경우, 피크 녹는 그림 3. Polygenomic은., 프로브 기반 HRM 분석은 단일 대립 유전자 샘플 (빨간색과 회색)과 일치 봉우리와 두 개의 피크 곡선 (오렌지)와 같은 두 대립 유전자를 나타냅니다. (. 다니엘스 등 DOI에서 적응 : 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">큰 V를 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 ersion. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> 그림 4. 돌연변이 대립 유전자 증폭 바이어스 (MAAB). A. 점진적으로 피크 polygenomic 또는 polyallelic 샘플에서 돌연변이 (저온) 대립 유전자에 대응하는 방향으로 융해 피크 반응이 증폭 어닐링 온도를 낮추는 편향. B. MAAB는 polygenomic 또는 polyallelic 시료에서 1 % 미만으로 존재 마이너 대립 유전자를 검출하기 위해 HRM 민감성을 초래한다. (. 파트 B는 다니엘스 등 DOI에서 적응 : 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 프로브 기반의 고해상도 녹는 증폭 반응의 표 1 세트입니다. <table><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 다시 당 볼륨행동 (96 웰 플레이트 및 모세관) </td><td> 반응 당 볼륨 (384 웰 플레이트) </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> HRM 마스터 믹스 </td><td> 4-5 μL </td><td> 2-2.5 μL </td><td> 1 개 </td></tr><tr><td> 10 × 초과 프라이머 </td><td> 1 μL </td><td> 0.5 μL </td><td> 0.50 μM </td></tr><tr><td> 10 × 다른 프라이머 </td><td> 1 μL </td><td> 0.5μl </td><td> 0.1 μM </td></tr><tr><td> 10 배 프로브 </td><td> 1 μL </td><td> 0.5 μL </td><td> 0.40 μM </td></tr><tr><td> PCR 등급 물 </td><td> 1-2 μL </td><td> 0.5 μL </td><td></td></tr><tr><td> 템플릿 DNA </td><td> 1 μL </td><td> 0.5 μL </td><td> 0.01 NG / μL </td></tr><tr><td></td><td> 10 μL </td><td> 5 μL </td><td></td></tr></tbody></table> 표 2. STANDARD 고해상도 녹는 증폭 조건. <table><tbody><tr><td> 온도 </td><td> 시간 </td></tr><tr><td> 보류 </td><td> 95 ° C </td><td> 120 초 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 45주기 </td><td> 95 ° C </td><td> 30 초 </td></tr><tr><td> 68 ° C를 * </td><td> 30 초 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1주기 </td><td> 95 ° C </td><td> 30 초 </td></tr><tr><td> 28 ° C </td><td> 30 초 </td></tr></tbody></table> *이 온도의 증폭에 의존 표 돌연변이 대립 유전자 증폭 바이어스 3. 증폭 조건. <table><tbody><tr><td> 온도 </td><td> 시간 </td><td> 사이클 </td><td> 램프 속도 </td><td> 획득 모드 </td><td> 분석 모드 </td></tr><tr><td> 변성하다 </td><td> 95 ° C </td><td> 30 초 </td><td> 1 </td><td> (20) </td><td> 없음 </TD&gt; <td> 없음 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 주기 </td><td> 95 ° C </td><td> 2 초 </td><td rowspan="2"> (55) </td><td> (20) </td><td> 없음 </td><td rowspan="2"> 부량 </td></tr><tr><td> 56 ° C를 * </td><td> 15 초 </td><td> (20) </td><td> 단일 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 용해 </td><td> 40 ° C </td><td> 0 초 </td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0.3 </td><td> 없음 </td><td> 없음 </td></tr><tr><td> 45 °의 C * </td><td> 0 초 </td><td rowspan="2"> 지속적인 </td><td rowspan="2"> 용해 </td></tr><tr><td> 90 °의 C * </td><td> 0 초 </td></tr></tbody></table> *이 온도의 증폭에 의존하고 MAAB을 수행 할 때 감소 될 것이다

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Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

고해상도 융점 분석은 이종 집단에서 단일 염기 다형성을 구별 할 수있는 능력을 제공하지만, 돌연변이 대립 유전자 증폭 바이어스 샘플 내의 비교적 낮은 비율로 존재 대립 유전자를 검출하는 능력을 증가시킬 수있다. 이 프로토콜은 고해상도 융점 분석의 감도를 향상 개선을 설명한다.

방법은 말라리아에 단일 염기 다형성 유전자형 녹는 고해상도의 감도를 증가

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K 조회수.  Harvard University.  고해상도 융점 분석은 이종 집단에서 단일 염기 다형성을 구별 할 수있는 능력을 제공하지만, 돌연변이 대립 유전자 증폭 바이어스 샘플 내의 비교적 낮은 비율로 존재 대립 유전자를 검출하는 능력을 증가시킬 수있다. 이 프로토콜은 고해상도 융점 분석의 감도를 향상 개선을 설명한다. 

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

연구

면역학 및 감염병학

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Heterokaryon 형성의 두 가지 방법 HCV 제한 요소를 발견하기

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

말라리아 모기의 2D 및 3D 염색체 페인팅

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화<em&gt; 표피 포도 구균</em&gt;와<em&gt; Mycobacterium의 박테</em&gt; 감염 신약 개발의 모델로

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

오버레이 분석을 사용하여 성적으로 폐렴 구균 박테리오신에 대한 세균의 생산 및 감도를 측정하는

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

고해상도 전자 현미경<em&gt; 헬리코박터 파이로리</em철 가용성의 다양한 조건에서 생산&gt; CAG 유형 IV 분비 시스템 필리

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

<em&gt; 체외</em&gt; HIV 공동 감염의 맥락에서 말라리아에 면역 반응을 측정하기위한 모델

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

방법은 세균 Pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

혈액 처리를위한 빠른 방법은 인간의 혈액에서 혈장 펩타이드 수준의 수율을 증가하는

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...