이 작품은 건강 DK074656 및 AI56374 (CEM)의 국립 연구소에서 보조금뿐만 아니라, 소아 당뇨병 연구 재단에 의해 지원되었다.

1. 세포의 준비 <ol><li> 대상 세포 배양 : 마우스 베타 세포 라인, NIT - 1 NIT - 4의 문화는 10 % FBS, 0.02 %의 BSA, 비 필수 아미노산, 15mM HEPES, 16.5mM와 보충 DMEM에서 이전에 설명한 1,2되었습니다 Glocose 및 페니실린 / 스트렙토 마이신. 5X10 4 세포에서 평면 바닥 96 - 웰 문화 플레이트에 51 피크 라벨, 종자 세포 / 음 200 μl 문화 매체하십시오. 에 대한 현미경 실험, 500 μl 문화 매체 챔버 당 5x10 4 8 - 잘 랩 - 탁 II chambered coverglass의 씨앗 세포, 그리고 세포 독성 실험에 사용하기 전에 48 시간 성장할 수 있습니다. </li><li> 제어 T 세포 라인 문화 : 부정적인 제어로 (ATCC, 인 경우에는 3 번 CD + 인간 림프구 세포주) Jurkat 세포주를 사용하십시오. RPMI1640의 문화 Jurkat 세포 10 % FBS와 보충 2 MM L - 글루타민, 1.5 g / L 나트륨 중탄산염, 10 MM의 HEPES 및 1.0 MM 나트륨 pyruvate. </li></ol> 2. 효과기 CD8 + T autoreactive 세포의 수집 및 활성화 NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD - AI4a]와 NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD - AI4b]는 잭슨 연구실 (바 하버, ME)에서 구입했다 저희 마우스 시설에서 자란. 와 NOD - AI4a의 matings에서 F1 잡종 자손 NOD - AI4b [NOD - AI4a / B] 시대의 3~5주에서 당뇨병을 개발합니다. 모든 생쥐는 무균 시설에서 보관되어 및 관련 기관의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. <ol><li> CO 2를 사용하여 3~4주 오래된 NOD - AI4a / B 쥐를 안락사. </li><li> 생쥐의 spleens를 수집합니다. Euthanized 생쥐는 에탄올 스프레이로 준비하고 수술 후드 아래에 열립니다. Spleens은 제거하고 즉시 얼음처럼 차가운 HBSS 버퍼에 넣어 있습니다. </li><li> 7 ML 유리 균질 화기를 사용하여 비장 세포를 수집합니다. 두 세 spleens 각각 차가운 HBSS 5 ML 넣고 7 ML 유리 균질 화기로 균질하고 있습니다. Homogenate 4에서 5 분 동안 1200rpm에서 수집 및 centrifuged 있습니다 ° C Sorvall RT7 + 원심 분리기를 사용하여. 세포 펠렛을 수집하고 있습니다. </li><li> hypotonic 솔루션 치료를 사용하여 적혈구를 제거합니다. 우박이 5 분 얼음 솔루션 / 비장 5 ML hypotonic로 처리되며, 다음 HBSS의 동일한 음량을 추가하여 무력화. 위에서, 원심 분리하여 세포를 수집, 50 ML HBSS에 resuspend. 셀 스트레이너를 통해 정지 세포를 통과하고 TrypanBlue의 얼룩과 hemocytometer를 사용하여 계산합니다. </li><li> 세포를 활성화합니다. RPMI1640에서 0.1 μm의 AI4 mimotope (아미노산 서열 YFIENYLEL) 25 U / ML IL - 2와 3 일간의 문화를 사용하여 5x10 6 / ML 및 활성화에 Resuspend 세포 10 % FBS와 보충 2 MM L - 글루타민, 1.5 g / L 나트륨 중탄산염, 10 MM HEPES 및 1.0 MM 나트륨 pyruvate. </li></ol> 3. 51 피크 자료 분석은 CML를 검토 <ol><li> 라벨 대상 세포 : 3 시간 μCi / 음과 문화 1 세포를 대상으로, 문화 매체로 3 번 씻어 51 피크를 추가합니다. </li><li> 최종 볼륨이 각각 잘에 추가 있도록 단계 2.5에서 언급한로 RPMI 1640 배지에 효과기 세포를 일시 중지하면 200 μl 있습니다. </li><li> 비율 : 표시 대상 세포의 최종 세척 후, (T E)를 대상으로 원하는 이펙터에서 대상 셀 문화 활성화 효과기 세포를 추가합니다. 0.4:1, 1시 1분, 2시 1분, 5시 1분, 10시 1분, 20시 1분과 50:1에서 T 비율 : 우리는 일반적으로 E를 사용합니다. </li><li> 자연 용해 제어 역할을 타겟 세포 6 웰스 신선한 수정 RPMI 1640 매체 (단계 2.5 참조) 추가합니다. </li><li> 16시간 공동 문화 효과기 및 대상 세포. </li><li> 6x50 mm 라임 유리 튜브에 뜨는 수집 </li><li> 100μl 2% SDS를 추가하고 부드럽게 여러 번 pipetting하여 세포를 Lyse. </li><li> 6x50 mm 라임 유리 튜브의 다른 집합에 세포 lysate를 수집합니다. </li><li> 깨끗한 H 2 O로 한 우물을 세척하고 세포 lysate 튜브에 세척을 추가합니다. </li><li> 감마 카운터를 사용하여 supernatants 및 세포 lysates 카운트. </li><li> 다음과 같이 구체적인 용해를 계산 : <img src="files/ftp_upload/2724/2724eq1.jpg" alt="방정식 1" /></li></ol> 4. 라이브 셀 이미징에 대한 세포의 스테 이닝 가장 일반적으로 사용되는 mitochondrial 막 잠재적인 염료 중 TMRM는 최소한 mitochondrial 독성을 전시하고 있습니다. 따라서 3 이러한 라이브 셀 이미징 연구 TMRM을 선택합니다. <ol><li> -20 ° C.에 DMSO와 저장소에 40 MM 주식 TMRM 솔루션을 준비 [25 NM] NIT - 1 세포 배양 1 모든 보충제와 페놀 레드없는 DMEM에 신선한 작업 솔루션을 확인하십시오. </li><li> 37 30 분 TMRM 25 NM과 목표 NIT - 1 세포를 얼룩 ° C. </li><li> 염료 4 평형 분포를 유지하기 위해 TMRM 5 nm의를 포함하는 새로운 미디어로 미디어를 교체합니다. </li><li> hematocytometer를 사용하여 활성화 효과기 AI4 T 세포를 계산합니다. </li><li> 1 μl / ML Picogreen 위해 함께 활성화 효과기 T 세포 AI4 스테인5 상온에서 분 페놀 레드없는 문화 중간 3 회와 함께 씻으십시오. </li></ol> 5. 라이브 셀 이미징을 사용하여 평가 T 림프구 - 중재 베타 세포를 파괴 <ol><li> 자이스 혈구 LSM 510 공촛점 현미경의 무대에 스테인드 NIT 세포와 chambered의 coverglass를 탑재합니다. dremmel 및 가스 etheline 산화와 chambered 유리를 소독과 탭을 제거합니다. 무대는 온도 37 ° C 제어 및 5% 수분과 CO 2.이 살아있는 세포 이미징 챔버를 갖추고 있습니다 </li><li> 활성화 추가 및 다른 전자에서 지정 방으로 스테인드 T 세포 : T 비율. </li><li> 제어 방으로 스테인드 Jurkat 세포의 같은 번호를 추가했습니다. </li></ol> 6. 라이브 셀 이미지를 얻기 현미경 우리가 반복 실험의 시간이 코스를 통해 자동으로 동일한 또는 다른 회의소와는 다른 위치에서 이미지를 얻기위한 허용 전동 무대를 갖추고 있습니다. <ol><li> 63x 오일 객관적인 렌즈를 사용하여, 위치 300 프레임의 총 매 3 분 간격으로 이미지를 가져가라. </li><li> 방출 565-619 NM 위해 여기 파장 543 nm의 길이 및 필터 집합을 사용하여 TMRM의 염색법을 감지 </li><li> 자극 488 NM 및 방출 500-630 nm의에 대한 필터 설정을 사용하여 Picogreen의 얼룩을 감지합니다. 비디오 자이스 혈구 LSM 소프트웨어를 사용하여 만들었습니다. </li></ol> 7. 게시를 위해 비디오 변환 <ol><li> 자이스 혈구 LSM 소프트웨어를 사용하여 AVI 포맷으로 압축되지 않은 동영상 파일을 만듭니다. </li><li> 출판 형식으로 비디오를 변환하려면, 소프트웨어 패키지 피지 (로 동영상을 가져올 <a href="http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji">http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji</a> ), ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info. nih.gov / 엘제이 /</a> LOCI (에서 Bioformats 플러그인 사용) 배포 <a href="http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats">http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats</a> ). </li><li> 녹색과 빨간색 신호와 프레임 속도는 애니메이션 옵션 메뉴를 사용하여 두 프레임 / 초로 설정되었습니다 균형을 밝기 및 대비 설정을 조정합니다. </li><li> 압축되지 않은 AVI 파일로 512 X 512 픽셀과 수출하기 위해 동영상을 자르기. </li><li> 소프트웨어 퀵타임 7 (애플 컴퓨터, 쿠퍼 티노, CA)에서이 AVI 파일을 열고 압축 및 1200 KBS / 초에서 열린 비디오 파일 형식 H264/MPEG-4으로 내보낼 수 있습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 : <ol><li> 51 피크 CML 분석의 대표적인 결과. 대상 비율 (X 축) 증가 : 그림 1은 %의 구체적인 용해 (Y 축)는 효과기 증가 CML 분석의 대표 결과를 보여줍니다. 대상 세포 immunodeficient NOD으로부터 격리 기본 아일 레츠 아르 Rag1 - / -. 생쥐 51 피크로 표시. NOD.AI4α / β 유전자 변형 생쥐에서 Splenocytes는 분리 단계 위의 2에서 설명한대로 활성화됩니다. 목표와 effectors는 16 시간 동안 공동 교양되었습니다. 위의 단계에서 설명한대로 3.11 %의 구체적인 용해가 계산됩니다. </li><li> T 세포 - 매개 베타 세포 mitochondrial 막 잠재적인 손실의 두 대표 (긍정적이고 부정적인) 결과가 표시됩니다. 세포가 묻은하고 반응은 4 단계, 5 이상 6 설명한대로 기록, 비디오 파일은 7 단계에서와 같이 만들어집니다. 비디오 1 : 마우스 베타 세포 라인 NIT - 1은 mitochondrial 막 잠재적인 염료 TMRM (레드) 스테인드되었습니다. 50:1의 비율 T : 활성화, CD8 + T autoreactive는 세포 AI4 (Picogreen 물들일 녹색)를 E에서 이러한 NIT - 1 세포와 공동 교양되었습니다. NIT - 1 mitochondrial 막 잠재력은 400 분 동안 점차 소산 기간,하지만 AI4 T 세포와 상호 작용 있던 클러스터 인치 비디오 2 : 제어 실험으로 NIT - 1 세포 TMRM 및 E에 Picogreen 스테인드 Jurkat 세포 공동 교양 물들일되었습니다 50:1의 비율 T. Jurkat 세포는 MHC 일치되는 인간의 T 세포 라인입니다. NIT - 1 세포가 공동 잠복기 400 분 전체 기간에 걸쳐 mitochondrial 막 잠재력을 유지. Jurkat 세포는 NIT - 1 클러스터와 상호 작용하지 않았고 따라서, 살인 유도하지 않습니다. </li></ol><img src="files/ftp_upload/2724/2724fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 CML의 대표 결과가 immunodeficient NOD.Rag1 - / 격리 대상 세포 기본 아일 레츠로 사용 -. NOD.AI4α / β 유전자 변형 생쥐에서 마우스 및 splenocytes. 목표와 effectors는 16 시간 동안 공동 교양되었습니다. 퍼센트 특정 용해는 효과기 증가 : 대상 비율이 증가합니다. 비디오 1. 마우스 베타 세포 라인 NIT - 1은 mitochondrial 막 잠재적인 염료 TMRM (레드) 스테인드했습니다. 활성 autoreactive CD8 + T는 세포 AI4 (Picogreen 물들일 녹색)이 NIT - 1 E의 전지와 함께 공동 교양되었습니다 50:1의 비율 T. NIT - 1 mitochondrial 막 잠재 dissipa테드는 점차 400 분 기간 동안,하지만 녹색 AI4 T 세포와 상호 작용 있던 클러스터 것은. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/video.mov">비디오를 볼하려면 여기를 클릭하십시오</a> . 비디오 1 Picogreen 스테인드 인간의 T 세포 라인 Jurkat 공동 양식에 설명된대로 동영상 2. NIT - 1 세포가 같은 얼룩되었습니다. NIT - 1 세포는 mitochondrial 막 잠재력 400분 기간을 생각을 유지할 수 있었다. Jurkat 세포는 NIT - 1 클러스터와 상호 작용하지 않았고 따라서 살인을 유발하지 않습니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/Video2.mp4">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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	<li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li><li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell.">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores.">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li><li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+immune-mediated+(type+1)+diabetes+mellitus:+potential+for+immunotherapy.">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li><li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+resistance+of+ALR/Lt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction:+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants.">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes.">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li><li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+membrane+potential+(deltapsi(m))+in+apoptosis;+an+update.">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li><li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways.">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li><li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha.">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li></ol>

동물 실험은 플로리다 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

세포 독성 T 세포 매개 베타 세포 죽음은 T1D 5 주 pathophysiology입니다. 51 피크 자료를 사용하여 CML의 assays은 우리가 효과기 - 목표 응답 6 정도를 공부하실 수 있습니다. 그러나, 세부적인 프로세스 및 T 세포 - 매개 베타 세포 사망 경로는 아직도 완전히 이해되지 않습니다. mitochondria가 베타 세포 기능과 사망 7 중요하기 ​​때문에, 우리는 시각 CML 동안 mitochondrial 변?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> CR - 51 </td><td> 퍼어킨 엘머 </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tetramethyl Rhodamine 메틸 에스테르 (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td> 아미노산 서열 : YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL - 2 </td><td> R &amp; D </td><td> 485 - MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11,885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 시그마 </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060 - CL </td><td></td></tr><tr><td> 멤 비 필수 아미노산 </td><td> GIBCO </td><td> 11,140 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> 쌍둥이 자리 </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> 페놀 레드없는 DMEM </td><td> 시그마 </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> CO2 인큐베이터 </td><td> 써모 피셔 </td><td> HeraCell 150i </td><td> 세포 배양을위한 무균 보관 </td></tr><tr><td> 생물 안전 캐비닛 </td><td> 써모 피셔 </td><td> 견적 1440 </td><td></td></tr><tr><td> 일회용 문화 튜브, 6x50 mm 라임 유리 </td><td> 어부 </td><td> 14-958 - </td><td></td></tr><tr><td> 감마 카운터 </td><td> 퍼어킨 엘머 </td><td> 마법사 1470 자동 감마 카운터 </td><td></td></tr><tr><td> 공촛점 현미경 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> LSM 510 메타 공촛점 </td><td> 전동 무대와 라이브 셀 챔버와 함께 </td></tr><tr><td> 피펫 (1ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 튜브 (앰버) </td><td> 어부 </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Sorvall 레전드 RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Hemacytometer </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> 입식 현미경 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ 쥐 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ 쥐 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD - AI4α / β F1 마우스 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> UF 동물 시설에서 자란 </td></tr></tbody></table>

methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes

제 1 형 당뇨병 (T1D)는 T 세포 매개 면역 질환이다. 인슐린 생산이 분실로 pathogenesis 동안, 환자는 T 세포에 의해 췌장 베타 세포의 파괴에서 아마도이 결과는 점차적으로 더 insulinopenic됩니다. T1D의 개발 기간 동안 베타 세포 죽음의 메커니즘을 이해하는 것은이 질병에 대한 효과적인 치료를 생성하는 통찰력을 제공할 것입니다. 셀 - 중재 lymphocytotoxicity (CML) assays는 역사적으로 대상 세포를 레이블 radionuclide 크롬 51 (51 CR) 사용하고 있습니다. 이러한 목표는 다음 효과기 세포에 노출되고 대상 세포에서 51 피크의 릴리스는 림프구 - 중재 세포의 죽음은 표시대로 읽습니다. 51 피크의 감소 릴리스에서 세포 사망 결과의 억제제. 효과기 세포, 우리는 CD8의 활성화 autoreactive clonal 인구 + 알파 및 AI4 T 세포 수용체 (TCR)의 베타 체인 모두에 대해 마우스 재고 유전자 변형으로부터 격리 세포 독성 T의 lymphocytes (CTL)을 사용합니다. 활성 AI4 T 세포는 16 시간 동안 51 피크 표시 대상 NIT 세포와 공동 교양 있었다, 51 릴리스는 피크는 특정 용해를 계산하기 위해 기록된 Mitochondria 같은 에너지 생산, 전달 시그널링 규제 및 apoptosis 등 많은 중요한 생리 이벤트에 참여할 수 있습니다. T1D의 개발 기간 동안 베타 세포 mitochondrial 기능 변화의 연구는 연구의 소설 공간입니다. mitochondrial 막 잠재적인 염료 Rhodamine Tetramethyl 메틸 에스테르 (TMRM)와 공촛점 미세한 라이브 셀 이미징을 사용하여, 우리는 베타 세포 라인 NIT - 1에서 시간이 지남에 따라 mitochondrial 막 잠재력을 감시. 이미징 연구, 효과기 AI4 T 세포는 형광 염색법 핵 염색 Picogreen으로 표시되었습니다. NIT - 1 세포와 T 세포가 chambered coverglass 공동 교양과 라이브 셀 챔버가 장착된 현미경 무대에 장착된 37에 지배되었다 ° C 5 % CO 2, humidified와 함께. 이러한 실험을하는 동안 이미지는 각 클러스터의 400 분 동안 매 3 분 촬영했다. 400분의 과정 동안, 우리는 AI4 T 세포가 첨부되었습니다 NIT - 1 셀 클러스터의 mitochondrial 막 잠재력의 낭비를 관찰했다. NIT - 1 세포가 MHC와 함께 공동 교양 있던 동시 제어 실험에 잘못이 검색 인간 림프구 Jurkat 세포를 mitochondrial 멤브레인 가능성은 온전하게 남아 있어요. 이 기술은 세포 독성 lymphocytes, 크린 시토킨 또는 다른 세포 독성 시약의 공격을 받고 세포 mitochondrial 막 잠재력에 실시간으로 변경 사항을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.

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Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

셀 - 중재의 lymphocytotoxicity (CML) assays는 체외에서 autoreactive 반응 및 세포 사망의 학습 메커니즘을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 형광 염료, 타입 및 세포 죽음뿐만 아니라 활용 경로의 반응 속도론 살 세포 공촛점 미세한 이미징 기술을 사용하여 더 자세히 공부하실 수 있습니다.

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

methods-to-assess-beta-cell-death-mediated-by-cytotoxic-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.3K 조회수.  University of Florida. 셀 - 중재의 lymphocytotoxicity (CML) assays는 체외에서 autoreactive 반응 및 세포 사망의 학습 메커니즘을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 형광 염료, 타입 및 세포 죽음뿐만 아니라 활용 경로의 반응 속도론 살 세포 공촛점 미세한 이미징 기술을 사용하여 더 자세히 공부하실 수 있습니다.

비디오: Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

탯줄 혈액에서 세포 독성 T 림프구 확장이 대상 사이토 메갈로 바이러스, 엡스타인 - 바 바이러스, 그리고 아데노 바이러스

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

연구

면역학 및 감염병학

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host cells1. These cells express a specialized receptor, called the T cell receptor (TCR), which can recognize a specific antigenic peptide bound to HLA class I molecules2. Engagement of infected cells or tumor cells through their HLA class I molecule results in production of lytic molecules such as granzymes and perforin resulting in target cell death. While it is useful to determine frequencies of antigen-specific CD8 T cells using assays such as the ELIspot or flow cytometry, it is also helpful to ascertain the strength of CD8 T cell responses using cytotoxicity assays3. The most recognizable assay for assessing cytotoxic function is the Chromium Release Assay (CRA), which is considered a standard assay 4. The CRA has several limitations, including exposure of cells to gamma radiation, lack of reproducibility, and a requirement for large numbers of cells. Over the past decade, there has been interest in adopting new strategies to overcome these limitations. Newer approaches include those that measure caspase 
release 4, BLT esterase activity 5 and surface expression of CD107 6. The impedance-based assay, using the Roche xCelligence system, was examined in the present paper for its potential as an alternative to the CRA. Impedance or opposition to an electric current occurs when adherent tumor cells bind to electrode plates. Tumor cells detach following killing and electrical impedance is reduced which can be measured by the xCelligence system. The ability to adapt the impedance-based approach to assess cell-mediated killing rests on the observation that T cells do not adhere tightly to most surfaces and do not appear to have much impact on impedance thus diminishing any concern of direct interference of the T cells with the measurement. Results show that the impedance-based assay can detect changes in the levels of antigen-specific cytotoxic CD8 T cells with increased sensitivity relative to the standard CRA. Based on these results, impedance-based approaches may be good alternatives to CRAs or other approaches that aim to measure cytotoxic CD8 T cell functionality.

The chromium release assay, a common assay for detecting cytotoxic T cell activity, has several limitations. Using antigen-specific CD8 T cells and the human breast cancer tumor line, SKBR3, in the present article, an impedance-based approach was examined for the capability of detecting cell killing.

xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

T Lymphocytes쪽으로 유도 Pluripotent 줄기 세포의 분화 감독

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on extracellular matrix proteins, for measuring the motility of fluorescently-labeled, non-adherent human or murine effector immune cells. This technique employs a stainless steel manifold and 10-well Teflon slide to focally deposit non-adherent T cells into wells prepared with either confluent tumor cell monolayers or extracellular matrix proteins. Light and/or multi-channel fluorescence microscopy is used to track the movement and behavior of the effector cells over time. Fluorescent dyes and/or viral vectors that code for fluorescent transgenes are used to differentially label the cell types for imaging. This method is distinct from similar-type in vitro assays that track horizontal or vertical migration/invasion utilizing slide chambers, agar or transwell plates. The assay allows detailed imaging data to be collected with different cell types distinguished by specific fluorescent markers; even specific subpopulations of cells (i.e., transduced/nontransduced) can be monitored. Surface intensity fluorescence plots are generated using specific fluorescence channels that correspond to the migrating cell type. This allows for better visualization of the non-adherent immune cell mobility at specific times. It is possible to gather evidence of other effector cell functions, such as cytotoxicity or transfer of viral vectors from effector to target cells, as well. Thus, the method allows researchers to microscopically document cell-to-cell interactions of differentially-labeled, non-adherent with adherent cells of various types. Such information may be especially relevant in the assessment of biologically-manipulated or activated immune cell types, where visual proof of functionality is desired with tumor target cells before their use for cancer therapy.

We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.

레이디 얼 이동성 및 레트로 바이러스 복제 벡터 형질 도입, 비 접착 Alloresponsive T 림프구의 세포 독성 기능

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

인간 팔라티노 편도선에서 B와 T 림프구에 대한 효율적인 분리 프로토콜

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

형광 상관 분광학에 의해 측정 된 차 림프구의 플라즈마 막 분자 확산

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

면역 마약 식별을위한 T 림프구에서 미토 겐 유도 블라스의 신속한 정량

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

독감 조류 특정 항 체에 의해 유도 된 Fc 중재 Effector 기능을 평가 하는 방법

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...