신뢰할 수 있는 동물 모델은 기본 연구의 중요한 구성 요소입니다. 우리의 뮤린 접근법은 포유류의 급성 폐 손상 발달의 기계론과 운동학에 대한 면역학적 질문에 대답할 수 있습니다. 최소한의 침습성, 간단한 취급뿐만 아니라 좋은 재현성은이 기술의 주요 장점입니다.
또한, 용량 적정으로, 우리는 임상 효과를 조절 할 수 있습니다. 이 기술은 가혹한 폐 상해를 가진 환자의 임상 상황을 반영하고 근본적인 기계장치를 조사할 수 있습니다. 리포폴리사카라이드(LPS)를 밀리리터당 5밀리그램의 농도로 알리쿼트에 섭씨 영하 20도에 보관하십시오.
내막 주입을 위해, 멸균 인산염 완충식식염에 해동된 LPS를 밀리리터당 2, 000 마이크로그램의 최종 농도로 희석한다. 22 게이지 정맥 카테터를 길이 20mm로 자른다. 37섭씨체온도를 유지하기 위해 온도 조절 테이블에 마우스를 놓습니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 마취에 따라 마취 하에 각막의 탈수를 방지하기 위해 멸균 안과 윤활제를 적용하십시오. 앞포가 테이블과 밀접한 접촉을 유지하면서 테이블 위에 약 5센티미터 떨어진 수평 막대에 머리와 후크 절개를 들어 올립니다. 테이블을 기준으로 90도 각도로 목을 슈퍼 확장합니다.
후두 위에 차가운 광원을 배치하여 성대를 시각화하고 기관지조를 조준합니다. 쉽게 삽관 조건을 위해 목을 곧게 하기 위해 혀를 집게합니다. 후두의 적절한 시각화 및 식별은 카테터의 올바른 장내 배치를 보장하는 데 중요합니다.
외부 냉광원은 이 단계에서 도움이 됩니다. 카테터를 기관체에 약 10mm 삽입합니다. 삽입이 너무 깊지 않은지 확인, 이것은 오른쪽 또는 왼쪽 주 기관지에 유체의 일방적인 주입 귀착될 것입니다.
후두의 저항이 발생하면 카테터를 몇 밀리미터 후퇴시킨 후 다시 전진하십시오. 이제 파이펫을 사용하여 LPS 희석 MPBS를 주입합니다. 주입된 볼륨은 마우스 체중에 따라 다릅니다.
주사기를 연결하고 50 마이크로리터의 공기 볼러스를 추가하여 완전한 액체 부피가 폐에 분포되도록 합니다. 카테터를 천천히 제거합니다. 기관에서 액체의 누출을 방지하기 위해 마우스의 상체를 30 초 동안 똑바로 배치하십시오.
수술 테이블에 테이프로 안락사 된 마우스를 고정하고 곧 70 %의 에탄올로 복부에 모피를 소독합니다. 가위와 핀셋으로 중앙선에서 복강을 조심스럽게 엽니다. 복부 대동맥의 척추 기둥에 대한 정맥 카바 열등한 권리에 대한 액세스를 달성하기 위해 장의 일부를 제거합니다.
신장 정맥을 찾아 정맥의 합류 바로 아래, 베나 카바 열등한에 1 밀리리터 주사기에 연결된 구부러진, 23 게이지 캐뉼라를 삽입합니다. 250 마이크로리터의 혈액을 흡인하고 0.5 개의 어금니 EDTA 용액의 20 마이크로 리터로 채워진 1.5 밀리리터 튜브로 이송합니다. EDTA 믹싱을 용이하게하고 얼음에 튜브를 넣어 부드럽게 흔들어.
기관지 알팔포라 라베이지의 경우, 멸균 PBS의 0.5 밀리리터와 공기의 0.1 밀리리터와 각각 세 밀리리터 주사기를 준비합니다. 목의 털을 70%에탄올로 소독하고 가위와 핀셋으로 기관지를 조심스럽게 노출시킵니다. 기관지를 동원하고 봉합사를 감싸는 다.
마이크로 가위를 사용하여 기관지를 뚫고 22 게이지 정맥 카테터를 삽입하여 길이20mm로 자른다. 봉합사로 카테터를 고정하고 멸균 PBS의 0.5 밀리리터와 0.1 밀리리터의 공기를 주입합니다. 60초 후에 유체를 흡입합니다.
추가 두 주사기와 절차를 반복하고 얼음에 15 밀리리터 튜브에서 전체 흡인을 수집합니다. 폐를 수확하기 위해 가위와 핀셋으로 흉부를 조심스럽게 엽니다. 비용 마진을 따라 다이어프램을 자르고 두 개의 측면 절개로 갈비뼈를 잘라냅니다.
조심스럽게 폐구멍을 피하십시오. 흉골을 두개골로 들어 올리고 수정하거나 제거합니다. 따뜻한 37도 PBS로 10밀리리터 주사기 2개를 준비합니다.
왼쪽 심실에 작은 절개를 합니다. 26 게이지 캐뉼라로 오른쪽 심실을 뚫습니다. 그런 다음, 미리 따뜻워진 PBS로 폐 순환을 플러시한다.
절차 도중 창백하게 되는 폐를 주의하십시오. 폐의 오른쪽 엽을 제거하고 반으로 자른다. 스냅은 액체 질소에서 동결한 다음 추가 유전자 발현 및 단백질 분석을 위해 영하 80도에서 장기 저장합니다.
왼쪽 폐 전체를 제거하고 가위와 핀셋으로 조직을 다진하여 48웰 플레이트에서 균질화합니다. 소화 완충제 2밀리리터에서 60분 동안 섭씨 37도에서 조직을 배양합니다. 폐 조직 조각을 위아래로 조심스럽게 배관하여 균질화를 수행하십시오.
혈액 샘플을 5밀리리터 FACS 튜브로 옮기고 혈액을 적혈구 리시스 버퍼 2밀리리터와 부드럽게 섞습니다. 얼음에 튜브를 넣고 얼음 차가운 PBS의 두 밀리리터를 추가하여 2 분 후에 반응을 종료합니다. 샘플을 400배 g에서 5분간 원심분리하고 상체를 폐기합니다.
이전에 설명된 프로토콜에 따라 후속 FACS 염색을 위한 FACS 버퍼 및 프로세스의 60 마이크로리터로 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 원심분리기 BAL 유체는 400배 g로 5분간. 슈퍼나티를 흡인시키고 액체 질소로 동결한 다음 추가 단백질 분석을 위해 영하 80도에서 장기 저장합니다.
차가운 FACS 버퍼의 두 밀리리터로 BAL 세포 펠릿을 다시 중단한 후, 100 미크론 메쉬 필터를 사용하여 5밀리리터 FACS 튜브로 서스펜션을 옮겨 모발을 억제합니다. 샘플을 원심 분리 한 후 이전에 설명 된 프로토콜에 따라 후속 FACS 염색을위한 FACS 버퍼 60 마이크로 리터와 펠릿을 다시 놓습니다. 이제, 100 미크론 메쉬 필터를 사용하여 소화된 좌폐 조직을 5밀리리터 FACS 튜브로 이송하여 덩어리를 추출합니다.
400배 g에서 5분간 시료를 원심분리하기 전에 얼음-차가운 FACS 버퍼 2밀리리터를 추가하여 소화 과정을 종료합니다. 상체를 폐기하고 이전에 설명된 프로토콜에 따라 후속 FACS 염색을 위한 FACS 버퍼 및 프로세스의 60 마이크로리터로 펠릿을 다시 중단합니다. FACS 분석을 위해 CD16/CD32 항체 차단 용액 20마이크로리터를 5밀리리터 튜브에 60마이크로리터의 세포에 추가합니다.
15분 동안 섭씨 4도에서 세포를 배양하여 Fc 수용체에 면역글로불린의 비특이적 결합을 차단한다. 한편, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 FACS 버퍼 및 항체와 마스터 믹스를 준비한다. 차단 후, 세포를 씻지 마십시오.
샘플당 항체 마스터 믹스 20마이크로리터를 추가하여 100마이크로리터의 최종 부피를 얻습니다. 샘플을 20분 동안, 어둠 속에서 섭씨 4도에서 배양합니다. FACS 버퍼와 원심분리기의 1밀리리터로 각 샘플을 이전과 같이 세척합니다.
상체를 폐기하고 FACS 버퍼로 펠릿을 FACS 측정에 적합한 세포 농도로 재보페수합니다. 마지막으로, 각 샘플에 시판되는 플루오로크롬 결합 교정 구슬의 고정 된 숫자를 추가하여 절대 세포 수를 결정합니다. 혈액, BAL 및 조직 세포에 대한 텍스트 프로토콜에 표시된 게이팅 전략을 사용하여 유동 세포 측정을 수행합니다.
24뿐만 아니라 72 시간 후 장내 주입, 폐 조직에서 TNF-알파의 발현은 크게 강화되었고, 대조군 동물에 비해 50 배 이상 증가했습니다. 조직및 폐포 공간으로류세포 침입은 급성 폐 손상의 발달을 위한 특징이자 특징이다. FACS 분석은 폐 간질로 호중구 과립세포의 중요한 침투를 밝혀, 절대 세포 수는 24 시간 후 제어에 비해 거의 9 배 증가.
절대 호중구 과립구 수는 72시간 후에 약간 감소했지만, 대조군에 비해 인자 증가가 유지되었습니다. 간질 호중구 과립세포 침투와 일치, 전체 폐 조직에서 MMP-9 발현도 마찬가지로 총 관찰 기간 동안 크게 증가했다. 호중구과구는 폐 조직에서뿐만 아니라 BAL 유체에서도 증가했습니다.
대조군 동물에 비해 접이식 증가는 폐 조직보다 더 두드러졌다. 폐 부종은 폐색증 장벽의 심각한 손상으로 인한 것으로 인해 급성 폐 손상의 발달을 위한 병증이다. ELISA에 의한 BAL 유체의 알부민 함량을 분석한 결과 LPS 주입 후 24시간 72시간 동안 장벽 기능이 현저히 상실된 것으로 나타났습니다.
적절한 카테터 배치는 LPS의 양자 주입에 매우 중요합니다. 종종 기침이나 헐떡거리는 것과 같은 호흡 패턴의 변화는 유체의 정확한 장내 주입을 나타냅니다. 급성 폐 손상의 유도에 따라, FACS 분석, PCR, 단백질 검출과 같은 다수의 후속 단계는 각각의 연구 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다.
