이 방법을 사용하면 헤테로다이머 형성과 같은 효율적인 테스트 샘플을 위해 공동 발현이 필요한 단백질 복합체의 형성을 연구할 수 있습니다. 이 방법의 주요 잠재력은 호환 가능한 벡터의 조합을 사용하여 차등적으로 태그가 지정된 연구 단백질의 공동 발현을 활용하여 효율적인 복잡한 조립을 촉진하고 시간 효율적인 워크플로 및 확장성을 통해 여러 상호 작용의 신속한 패치 테스트를 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 최적의 단백질 발현 및 정제 조건의 신속한 스크리닝에도 사용할 수 있습니다.
시각적 데모는 co-expression 설정, 세포 중단 및 후속 풀다운 단계와 같은 프로토콜의 중요한 단계를 올바르게 수행하는 데 도움이 됩니다. 시작하려면 섭씨 37도의 Luria-Bertani 또는 LB 배지에서 대장균 BL21(DE3) 균주를 0.1에서 0.2의 광학 밀도(OD)로 성장시킵니다. 박테리아 현탁액 1 밀리리터를 섭씨 4도에서 9, 000 G에서 1 분 동안 원심 분리하고 상청액을 버린다.
그런 다음 0.5 밀리리터의 얼음 차가운 변환 완충액 (TB)을 넣고 얼음에서 10 분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 섭씨 4도에서 8, 000 G에서 30 초 동안 원심 분리하고 상청액을 버린다. 그런 다음 TB 버퍼 100마이크로리터, 각 벡터 100나노그램을 추가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다.
섭씨 42도에서 150초 동안 가열한 다음 얼음에서 1분 동안 식힙니다. 다음으로, 항생제가없는 LB 배지 1 밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 90 분 동안 배양합니다. 배양 후, 0.5% 포도당 및 해당 항생제를 함유하는 LB 한천 플레이트에 현탁액을 도금하기 전에 100마이크로리터의 LB 배지에 펠릿을 원심분리하고 재현탁합니다.
접시를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 2 밀리리터의 LB 배지로 플레이트에서 세포를 해당 항생제와 함께 50 밀리리터의 LB 배지로 플러시합니다. 후속 실험을 위해 섭씨 영하 70도에서 20% 글리세롤이 포함된 분취량을 저장하기 전에 금속 이온 또는 기타 알려진 보조 인자를 추가합니다.
섭씨 37도에서 220RPM의 일정한 회전으로 세포를 0.5에서 0.7의 OD로 성장시킵니다. 배양액을 실온으로 냉각하고 IPTG를 1 밀리몰의 최종 농도로 첨가한다. 유도되지 않은 샘플의 대조군으로서 세포 현탁액의 20 마이크로리터 분취액을 저장한다.
섭씨 18도에서 220RPM으로 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 다음날, 박테리아 현탁액을 두 부분으로 나누고 단백질 발현을 확인하기 위해 20 마이크로 리터 분취량을 저장합니다. 나머지 세포 현탁액을 4, 000 G에서 15 분 동안 원심 분리한다.
풀다운 분석을 위해, 실험 직전에 프로테아제 억제제 및 환원제가 첨가된 1밀리리터의 얼음-차가운 용해 완충액에 펠릿을 재현탁시킨다. 테스트된 단백질에 대한 완충액 조성을 조정합니다. 얼음 위에서 초음파 처리하여 세포를 파괴하고 전기 영동을 위해 20 마이크로 리터 분취량을 저장합니다.
16, 000 G에서 30 분 동안 원심 분리하고 전기 영동을 위해 정화 된 용해물 20 마이크로 리터를 수집한다. 수지를 1 밀리리터의 얼음 차가운 용해 완충액으로 10 분 동안 평형시킨 다음 2, 000 G에서 30 초 동안 원심 분리하고 상청액을 버린다. 세포 용해물을 수지에 첨가하고 15RPM의 일정한 회전으로 10분 동안 배양합니다.
이어서, 분석을 위해 결합되지 않은 분획 20 마이크로리터를 수집하기 전에 원심분리하고 상청액을 버린다. 다음으로, 1 밀리리터의 얼음처럼 차가운 세척 완충액을 넣고 1 분 동안 배양합니다. 다시, 원심분리하고 상층액을 버린다.
그런 다음 얼음처럼 차가운 세척 버퍼로 두 번 길게 세척합니다. 2차 세척 후, 결합된 단백질을 50 마이크로리터의 용출 완충액으로 1, 200 RPM의 진탕기에서 섭씨 4도에서 10분 동안 용출시킨다. 용출된 단백질을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석합니다.
징크 핑거 관련 도메인(ZAD), 맥아당 결합 단백질의 호모 이량체화(MBP) 및 6xHistidine 풀다운 분석에 대한 연구가 여기에 나와 있습니다. MBP와 티오레독신 6x히스티딘 융합 ZAD의 공동 발현은 MBP 풀다운 분석의 SDS-PAGE 결과에서 추가 밴드로 나타나는 우수하고 재현 가능한 동종이량체화 활성을 보여줍니다. 대안적인 복합체 형성을 연구하기 위해 이 방법을 사용하는 또 다른 예가 여기에 나와 있습니다.
동시 발현 분석에서, 6x히스티딘 태깅된 ENY2는 GST-태깅된 Sgf11 및 MBP-CTCF 둘 다와 상호작용했지만, MBP 풀다운에는 GST-Sgf11이 존재하지 않았고 그 반대의 경우도 마찬가지였다. 동시 발현과 결합된 풀다운과 비교하여 기존 풀다운 분석의 워크플로우에서 필요한 시간 간격의 단계별 비교가 여기에 나와 있습니다. CP190 단백질의 BTB 도메인과 초파리 CTCF 단백질의 GST 태그 C-말단 도메인 사이의 동일한 상호작용을 연구하기 위해 두 기술을 모두 활용한 결과가 여기에 나와 있습니다.
친화도 및 용해도 테스트, 티오레독신, GST 또는 MBP의 올바른 선택은 분석의 효율적인 실행에 매우 중요합니다. 또 다른 중요한 단계는 빠르고 균일한 세포 파괴입니다. 다중 팁 초음파 처리기 프로브를 사용하는 것이 좋습니다.
이 방법을 사용하면 기존의 풀다운 분석에서 정제된 단백질의 배양 중에 분리되지 않는 동종이량체를 형성하는 단백질 도메인 간의 이종이량체 형성을 직접 연구할 수 있습니다.
