이 절차의 전반적인 목표는 2D 견인력 현미경 연구를 위한 마이크로 패턴 하이드로겔을 제조하는 것입니다. 이것은 먼저 메타크릴유리 커버 슬립을 만들고 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 첫 번째 층을 형성함으로써 달성된다. 두 번째 단계는 견인력 현미경 검사법을 위한 형광구슬을 포함하는 또 다른 하이드로겔 층을 만드는 것이다.
하이드로겔은 마이크로 패턴 커버 슬립으로 끼어 하이드로겔 표면에 마이크로 패턴 매트릭스 단백질을 전달합니다. 다음으로, 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 45분 동안 실온에서 중합하게 된다. 그런 다음 상단 덮개 슬립을 조심스럽게 제거합니다.
형광 현미경 이미징은 구슬의 존재와 마이크로 패턴 외세포 매트릭스 단백질의 성공적인 전달을 보여주기 위해 사용됩니다. 이 방법은 빛의 방출을 사용하여 여러 견인력을 효율적이고 정확하게 측정하는 데 도움이 됩니다. 동일한 샘플에서 더 많은 수의 실험 관찰을 얻을 수 있습니다.
그래서 절차를 시연하는 것은 조엘 크리스천, 내 실험실에서 대학원생이 될 것입니다. 10 밀리리터의 이중 증류수를 비커에 넣습니다. 후, 아세트산 18.75 밀리리터, 3프로필 메타크릴레이트 18.75밀리리터, 용액에 에탄올 252.5 밀리리터를 첨가한다.
용액이 완료되면 구체화된 접시로 옮습니다. 24mm 원형 커버 슬립을 가지고 정밀 한 닦아로 청소하고 사용자 정의 만든 테플론 랙에 넣습니다. 그런 다음 용액에 담그고 15 분 동안 배양하십시오.
랙을 가지고 에탄올로 헹구세요. 공기 흐름 에서 덮개 전표를 건조. 메타크릴드 커버 슬립은 실온에서 최대 1개월까지 보관할 수 있습니다.
15mm 라운드 커버 슬립을 타고 페트리 접시에 놓습니다. 다이아몬드 펜을 사용하여 커버 슬립의 위쪽을 표시합니다. 그런 다음 산소 플라즈마 처리를 통해 청소를 진행합니다.
커버 슬립은 0.4 밀리바, 200 와트로 2분간 깨끗합니다. 파이펫 100 마이크로리터의 0.01%의 폴리-L-Lysine 용액을 커버 슬립의 표면에 올리고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 후, 8.5의 pH에서 10 밀리머로 커버 슬립을 씻어.
여분의 액체를 꺼내지만 표면을 젖게 하십시오. 10 밀리머 pH 8.5 용액에서 mPEG-SVA의 밀리리터 당 50 밀리그램의 파이펫 100 마이크로리터는 실온에서 1 시간 동안 커버 슬립 및 인큐베이션의 표면에 용액을 공급합니다. 후, 10 밀리머 pH 8.5로 커버 슬립을 헹구는 다.
그런 다음 PLPP 젤의 마이크로리터 2개를 추가한 다음 표면에 40마이크로리터의 에탄올을 첨가합니다. 페트리 접시를 부드럽게 기울여 용액을 균질화합니다. 솔루션이 편광될 때까지 5분 간 기다립니다.
커버 슬립을 35mm 하단 홀 페트리 접시 안에 놓습니다. 현미경 단계에 커버 슬립이 들어 있는 페트리 접시를 넣습니다. 유리 표면에 초점을 조정합니다.
미리 그려진 패턴을 로드하고 잠급합니다. 제곱된 밀리미터당 30밀리줄의 UV 용량으로 패터닝을 시작합니다. 패터닝 단계를 완료한 후 패턴 커버 슬립을 꺼내 PBS로 표면을 헹구십시오.
실온에서 1시간 동안 PBS에 용해된 Alexa 488과 결합된 밀리리터 피브리노겐 당 25 마이크로그램의 100 마이크로리터 혼합물과 25 마이크로그램의 샘플을 배양합니다. 하이드로겔 기판을 준비하려면 메타크릴드 커버슬립을 페트리 접시에 넣는 것으로 시작합니다. 시작하려면 9.55 밀리리터의 이중 증류수를 15밀리리터 팔콘 튜브에 추가하여 신선한 산화 AgA 솔루션을 준비하십시오.
그런 다음 AgA의 0.5 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 42 밀리그램의 메타 피루바테 나트륨을 용액에 추가합니다. 셰이커에 솔루션을 4시간 동안 설정합니다.
그런 다음 표 1에 따라 아크릴아미드, 비스 아크릴아미드 및 이중 증류수를 혼합하여 스톡 솔루션을 준비합니다. 스톡 솔루션은 섭씨 4도에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다. 99.3 마이크로리터의 스톡 용액을 0.5 마이크로리터의 심모늄 감산 염 1%와 0.2 마이크로리터를 TEMED의 0.2 마이크로리터로 혼합하여 바닥층을 위한 작업 용액을 준비한다.
용액에서 10 마이크로리터를 가져 와서 파이펫 드롭 와이즈를 메타크커버 슬립에 놓습니다. 조심스럽게 물방울에 15mm 둥근 커버 슬립을 놓고 중합할 때까지 45 분 기다립니다. 다음으로, 메스와 상단 커버 슬립을 분리합니다.
그런 다음 93.3 마이크로리터의 스톡 용액을 마이크로리터 산화 HEA 1개, 마이크로리터 형광구 비드 5개, 아황아상 1% 및 0.2 마이크로리터를 혼합하여 상부 층을 위한 작업 용액을 준비한다. 용액에서 5마이크로리터를 꺼내 파이펫을 바닥 층 하이드로겔에 떨어뜨립니다. 마이크로 패턴 커버 슬립을 물방울에 조심스럽게 놓습니다.
45분 간 기다렸다가 중합할 때까지 기다립니다. 커버 슬립을 메스로 부드럽게 분리합니다. 그리고 커버슬립을 맞춤 드릴 6웰 플레이트의 바닥에 붙입니다.
우물에 PBS를 추가합니다. 세포를 보려면 6웰 플레이트에서 PBS를 흡인합니다. 섬유 아세포에 대 한, L-글루타민을 포함 하는 높은 포도 당 DMEM을 추가 하 고 10%FPS와 1%페니실린과 연쇄 상 감으로 보충.
하룻밤 사이에 세포를 섭씨 37도, CO2 5%로 배양합니다. 현미경 단계에 대한 CO2 및 가열을 켭니다. 그런 다음 현미경을 켜고 우물 접시를 무대에 놓습니다.
조명 패턴을 설정하고 관심있는 세포를 표시합니다. 하이드로겔 표면에 다시 초점을 맞춥니다. 브라이트필드 채널에서 셀의 이미지를 획득합니다.
변형된 상태에서 구슬의 이미지를 찍려면 채널로 전환합니다. 그런 다음 레이저 채널로 전환하고 3 분 동안 패턴에 따라 세포를 비춥춥시다. 이것은 제곱 된 밀리미터 당 6, 000 밀리줄의 복용량에 해당합니다.
그 후, 채널을 전환하고 변형되지 않은 상태에서 구슬의 이미지를 획득한다. 견인력을 계산하려면 측면 드리프트에 대해 이미 수정한 형광 비드 이미지를 엽니다. 견인력에 대한 전체 분석은 연결된 스크립트에 자세히 설명되어 있습니다.
하이드로겔 표면의 마이크로 패턴 부위에 대한 세포의 선택적 접착을 확인하기 위해 샘플은 미리 표지된 매트릭스 단백질을 사용하고 세포를 시각화하기 위해 밝은 필드 현미경 검사법을 사용하여 형광 현미경으로 이미지화되었습니다. 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 기계적 특성은 아크릴아미드와 비스 아크릴아미드의 다양한 양을 혼합하여 다양했다. 하이드로겔의 강성은 원자력 현미경검사법에 의한 나노 들여쓰기 실험으로 평가되었다.
격노체 력 측정은 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 미크론 크기의 영역을 선택적으로 조명하기 위해 공간, 현세적으로 제어된 자외선 레이저 빔 조명을 적용한 후 수행되었다. 일반화된 교차 유효성 검사에서 선택한 정규화 매개변수를 사용하여 트랙션 력을 재구성했습니다. 어트랙션 포스 현미경 검사법과 마이크로 패턴 세포의 발광과 결합된 당사의 모델 모듈식 접근 방식은 다재다능하며 다른 현미경 검사법과 이미징 설정과 함께 해상도와 감도를 향상시킬 수 있습니다.
