Campylobacter 문화의 어려움은 질병을 일으키기 위하여 얼마나 몇몇 박테리아가 필요한가와 같은 근본적인 연구 결과를 억제했습니다. 여기에 사용되는 이러한 결합된 분석 및 고안된 샘플은 이 문제를 해결할 수 있습니다. 이 기술은 임상 관련 환자 증상이 양성 배설물 배양 결과와 처음으로 실제 수의 박테리아와 상관관계가 될 수 있게 합니다.
얼마나 많은 박테리아가 질병과 상관관계가 있는지 를 배우는 것은 진단을 제공할 것이며, 검출을 위한 중요한 목표및 긴장 또는 Campylobacter의 종 사이 독성을 비교하기 위한 단단한 방법. Campylobacter 문화는 간단하지만 정량적 생존을 유지하기 위해 빠르고 조직적인 준비가 필요합니다. 접시에 경쟁 배설물 식물 사이 캄필로박터 식민지를 식별 하기 위해 상당한 판단이 필요 하다.
C.jejuni 또는 C.coli 문화를 시작하기 전에 장갑, 실험실 코트 및 안전 안경을 착용하고 소독 된 라미나르 흐름 안전 후드 내에 일회용 보호 시트를 놓습니다. 멸균 기술을 사용하여 모든 수화 또는 해동 된 세균 육수를 Campylobacter 특정 한천 판에 줄이며 소조균 가스가 생성되는 혐기성 항아리에 48 시간 동안 37도의 접시를 놓습니다. 24 시간 후, 느슨하게 BHI 국물의 플라스크를 커버하고 37 섭씨에서 하룻밤 잠복에 대한 미세 조개 환경을 생산하는 봉지와 새로운 혐기성 항아리에 플라스크를 배치합니다.
다음 날 아침, 미리 감소된 국물의 3밀리리터와 접종 루프를 사용하여 Campylobacter 문화의 스타터 플레이트를 긁어냅니다. 슬러리를 멸균 튜브로 옮기고, 스크랩된 슬러리의 3밀리리터로 미리 감소된 국물의 나머지 97밀리리터를 접종한다. 배양이 400 나노미터에서 광학 밀도에 도달 할 때까지, 가스 봉지와 항아리에 국물을 놓고 48 내지 72 시간 동안 흔들리는 인큐베이터에 분당 37도 및 115 회전에서 배양.
이러한 순수한 주식 배양에서 박테리아의 수를 확립하기 위해 900 마이크로리터의 희석제 100 마이크로리터의 100마이크로리터 8개를 수행한다. 멸균 도금 구슬을 사용하여, 1회 100마이크로리터를 음의 5분의 1로 10대 10에 음수 7분의 1로 확산하여 중복된 사전 감소된 캄필로박터 에 대한 음의 일곱 번째 희석제에 100마이크로리터를 확산시키고, 플레이트를 희석 농도로 적힌 제1음절 에 넣고 37도에서 48~72시간 동안 가스를 생성하는 가스를 가진 제2 혐기성 항아리에 접시를 넣습니다. 성장 기간의 끝에서 계산에 대한 30 ~ 300 식민지 사이의 플레이트를 선택합니다.
카운트 후 수식에 따라 주식 국물 문화의 밀리리터 당 식민지 형성 단위를 결정하기 위해 카운트를 사용합니다. 이 스파이크 배설물 풀을 사용하여 모든 단계를 뒷받침하기 때문에 분석 식민지 수는 정확하다는 것이 중요합니다. 시연된 대로 계산을 위해 도금 한 직후, 동일한 양의 국물과 캄필로박터 네거티브 배설물 풀을 혼합하고 네거티브 배설물 풀에 9개의 후속 2배 희석제로 만들고, 배설물 풀에 캄필로박터가 없는 국물을 포함하는 컨트롤 플레이트를 추가하여 비캄필로박터 식민지를 식별할 수 있도록 도와줍니다.
각 Campylobacter 의자 희석제 10개 마이크로리터를 복제된 사전 감소된 Campylobacter 특정 한천 판에 희석하고 약 48시간 동안 섭씨 37도에서 봉지를 생성하는 가스로 혐기성 항아리에 플레이트를 배양합니다. 잠복이 끝나면 순수한 캄필로박터 문화와 유사한 식민지에 대한 줄무늬 판을 시각적으로 검사합니다. 식민지가 실제로 캄필로박터인지 확인하기 위해 그램 염색을 위해 콜로니와 같은 여러 Campylobacter를 선택하고 기름 침수 렌즈를 사용하여 가벼운 현미경 검사법에 의해 얇게 줄무늬 영역을 시각화하여 그람 음성 곡선, 나선형 또는 시가 모양의 작은 박테리아를 식별합니다.
캄필로박터를 첨가하지 않은 네거티브 컨트롤 플레이트는 다른 배설물 식물군을 식별하는 데 중요합니다. 문화 감지의 한계를 시각적 캄필로박터와 같은 그램 네거티브 식민지를 포함하는 마지막 희석을 고려하십시오. 그리고 고안된 임상 배설물 시편에서 양성 희석의 밀리리터 당 콜로니 형성 단위를 계산하기 위해 포뮬러를 사용한다.
수송 매체에 저장된 Campylobacter의 생존가능성을 결정하기 위해 캄필로박터 국물 배양의 1 밀리리터를 음의 배설물 풀 1밀리리터로 혼합하고 음의 배설물 풀에서 10개의 중복 2배 연속 희석을 준비한다. 또한 캐리 블레어 배지에서 1~4비율로 각 희석을 희석하고 20개의 희석 튜브와 캐리 블레어 배지에 96시간 동안 2~8도의 캡 튜브에 음의 대조를 저장합니다. 0시부터 24시간마다 각 희석의 10 마이크로리터 알리쿼트가 캄필로박터 선택적 한천 판에 적어 48시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.
환자 시료로부터 정확한 세균수를 확립하는 독립적인 방법이 없기 때문에 두 개의 동시 측정은 하나의 순수한 세균 육수로 이루어질 수 있다. 한 가지 테스트는 대변 매트릭스에서 주식 박테리아의 연쇄 희석으로부터 Campylobacter 식민지의 시각적 검출에 사용되며 임상 표본을 시뮬레이션합니다. 다른 시험은 분석은 분석은, 스파이크에 사용되는 동일한 박테리아 스톡 배양에 존재하는 밀리리터 당 식민지 형성 단위를 정량화한다.
성공을 위한 중요한 매개 변수는 스파이크 대변 문화의 이 대표적인 판에 의해 설명된 바와 같이 경쟁 적인 대변 식물 중 정확한 크기의 식민지를 식별하는 것입니다. 여기서, 7개의 독립적인 실험에서 일반적인 데이터를 관찰할 수 있다. 배설물 문화 내에서 캄필로박터와 유사한 식민지를 식별하는 것만으로는 충분하지 않습니다.
모든 식민지는 그램 얼룩 또는 더 진보 된 방법으로 확인되어야한다. 우리는 C.upsaliensis 또는 C.lari와 같은 드문 종을 검출하기 위해 배양보다 더 정확한 효소 면역 분석술을 사용하여, 이는 한천을 포함하는 표준 항생제에 제대로 성장합니다. 이 기술은 Campylobacter의 비 증상 캐리지와 같은 것들을 연구하고 높은 세균부하가 캄필로박터 감염의 심각한 결과를 초래할 위험이 높은 환자를 두었는지 여부를 연구하는 데 필요한 토대를 마련합니다.
종종 전염성이 있고 위험할 수 있는 박테리아와 함께 작업할 때 항상 PPE를 착용하며 건강한 기증자로부터 수집된 경우에도 알 수 없는 병원체를 함유할 수 있는 부정적인 배설물 풀을 착용하십시오.
