이오노마이신을 사용하여 홍도를 유도하기 위한 많은 노력이 있었습니다. 그러나 이 과정에 대한 정확한 절차는 문헌에 명확하게 설명되어 있지 않습니다. 우리는 이오노마이신을 사용하여 홍안염을 유도하는 단계별 절차를 제공합니다.
이 절차의 주요 장점은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방식으로 인간의 적혈구에 있는 적혈구를 유도하는 것입니다. 시작하려면 산성 구연산 덱스트로오스에 500 마이크로리터의 감기 전혈을 미세 원심분리기 튜브에 추가하십시오. 실온에서 5분 동안 700배 g의 전체 혈액을 원심분리하고 파이펫을 사용하여 맑은 플라즈마와 얇은 버피 코트를 제거하여 적혈구층을 남깁니다.
염화 나트륨 125밀리머 나트륨, 염화칼륨 5개, 밀리머 마그네슘 황산염 1개, 밀리머 헤페스 32개, 밀리모어 포도당 5개, 염화칼슘 1개를 함유한 링거 용액 1리터를 준비합니다. 1개의 어금니 나트륨 수산화물의 2개의 마이크로리터 방울을 추가하여 pH를 7.4로 조정합니다. 포도당 없는 링거 용액을 준비하려면 동일한 프로토콜을 따르지만 용액에는 포도당을 포함하지 마십시오.
링거 용액의 1.5 밀리리터에서 세포 펠릿을 중단하고 실온에서 5 분 동안 700 배 g에서 원심 분리하고 상퍼를 제거하여 링거 용액에서 적혈구를 두 번 세척하십시오. 그런 다음 9, 960 마이크로리터의 적혈구 펠릿 40 마이크로리터를 재중단하여 10 밀리리터의 최종 부피에 도달함으로써 0.4%의 헤마토크릿을 만듭니다. 7일 동안 세포 현탁액을 섭씨 37도에서 배양합니다.
포도당 없는 완충제에서 적혈구의 사전 잠복은 적혈구를 크게 유발합니다. 높은 홍변은 무설탕 완충제에서 7일간의 사전 배양 후 수득하였다. DMSO의 630 마이크로리터에 1밀리그램의 이오노마이신 칼슘 소금을 녹여 2밀리알러의 최종 농도에 도달하십시오.
알리쿼트 20 밀리리터에 보관하고 영하 20도에 보관하십시오. 준비된 0.4%의 헤마토크릿 1밀리리터를 복용하고 2개의 밀리머 이오노마이신의 0.5 마이크로리터를 추가하여 1개의 마이크로몰라의 최종 농도에 도달하십시오. 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양하세요.
이오노마이신 처리없이 헤마토크릿의 1 밀리리터를 부정적인 대조군으로 사용하십시오. 원심 분리는 실온에서 5 분 동안 700 배 g에서 치료및 처리되지 않은 혈종으로 처리되고 처리되지 않은 혈종을 원심분리하고 체퍼나티를 제거하여 세포 펠릿을 튜브 바닥에 둡니다. 링거 용액의 1.5 밀리리터에서 세포 펠릿을 일시 중단하고 실온에서 5 분 동안 700 배 g에서 원심 분리하고 슈퍼 네이티퍼를 폐기하여 링거 용액으로 세포를 세 번 세척하십시오.
혈연을 측정하기 위해, 처리되지 않은 0.4% 혈종투에 1밀리리터를 마이크로센트심리후각관에 넣고 0%의 혈청을 부정적으로 조절할 수 있도록 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양한다. 100% 혈혈의 긍정적 인 제어를 준비하려면, 실온에서 5 분 동안 700 배 g에서 미세 원심 분리기 튜브및 원심 분리기에 처리되지 않은 0.4 %의 혈종 1 밀리리터를 추가하십시오. 상체를 제거하고 세포 펠릿에 증류수 1밀리리터를 추가하여 섭씨 37도에서 2시간 동안 재일시 중단하고 배양합니다.
다음으로, 마이크로센트심분리기 튜브에 0.4%헤마토크릿 처리된 이오노마이신의 밀리리터 1개를 추가한다. 처리되지 않은 세포, 처리된 세포 및 증류수의 세포를 실온에서 5분 동안 700배 g에서 원심분리합니다. 슈퍼네티츠의 마이크로리터 200개를 96웰 플레이트의 각 웰에 옮기.
마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 541 나노미터에서 흡광도를 측정합니다. A0, A100 및 AT가 링거 용액의 적혈구의 흡수력과 요오노마이신에 의한 처리된 에르티로시테스의 흡수도인 방정식을 사용하여 용혈을 계산합니다. PBS의 8밀리리터에 5X 부속서-V 바인딩 버퍼의 2밀리리터를 희석하여 1X 바인딩 버퍼를 얻습니다.
1X 결합 버퍼의 1 밀리리터에서 이오노마이신 처리 및 처리되지 않은 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 결합 버퍼에서 세포 현탁액의 235 마이크로 리터를 가져 와서 마이크로 센트심분리기 튜브에 부속서-V 알렉사 플루오 488 컨쥬게이트 15 마이크로리터를 추가하십시오. 어두운 곳에서 20 분 동안 실온에서 세포를 배양하십시오.
원심분리기는 실온에서 5분 동안 700배 g로 원심분리기. 상부체를 제거합니다. 1X 결합 버퍼로 셀 펠릿을 1.5 밀리리터로 일시 중단하고 실온에서 5분 동안 700배 g에서 원심분리를 하여 세포를 두 번 세척한다.
유동 세포측정을 위한 1X 결합 버퍼의 250마이크로리터에서 상체를 제거하고 세포 펠릿을 재축한다. 이제 200개의 마이크로리터를 부속-V 스테인드 에리스로사이클을 유동 세포측정과 호환되는 1밀리리터 라운드 바닥 폴리스티렌 튜브로 이송합니다. 흐름 세포 측정 소프트웨어에 로그인하고 새 실험 버튼을 클릭합니다.
새 튜브 버튼을 클릭합니다. 글로벌 시트를 선택하고 488 나노미터의 발산 파장과 530 나노미터의 방출 파장으로 형광 강도를 측정하기 위해 적용 분석을 선택합니다. 형광 활성화 된 세포 선별 분석을 위해 수집될 세포 수를 20, 000으로 설정합니다.
원하는 튜브를 선택하고 로드 버튼을 클릭합니다. 앞으로 산란 및 측면 산란 측정을 위해 레코드 버튼을 클릭합니다. 모든 샘플에 대해 반복합니다.
표본 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 배치 분석을 적용하여 결과 파일을 생성합니다. 표본 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 FSC 파일 생성을 클릭합니다. 이 프로토콜에서, 2시간 동안 1개의 마이크로몰라 이오노마이신 및 링거 용액을 가진 적혈구의 처리는 FACS 분석에 의하여 부속신-V 플루서 488 의 성공적으로 라벨링에 의해 입증된 바와 같이 적혈구를 유도하기에 충분했습니다.
5 및 10 마이크로 몰라에서 이오노마이신의 높은 농도는 홍도증의 약간의 증가를 초래했다. 그러나, 이러한 농도 또한 혈혈증을 향상. 이오노마이신및 링거 용액에서 적혈구를 30분 간 배양하는 것만으로도 홍안증을 유발하기에 충분했다.
인큐베이션 시간이 증가하여 최대 2시간 동안 홍도 수준을 증가시다. 그러나, 추가 잠복기 시간은 홍하의 수준에 있는 약간 감소귀착되었습니다. 180분 후에 혈혈의 더 높은 값은 이오노마이신으로 처리의 180분에 존재하는 보다 적게 실행 가능한 세포로 인큐베이션의 동일한 양 후에 적층의 감소를 설명합니다.
이오노마이신 치료를 가진 적혈구는 외부 전단지에서 인스파디딜 세린에 대한 부속서-V의 결합에 밝은 형광 신호를 보였다. 대조적으로, 처리가 없는 세포는 아주 낮은 홍위를 나타내는 아주 약한 형광 신호를 보여주었습니다. 포도당 없는 완충제에서의 사전 잠복은 홍안증유도를 위한 중요한 트리거입니다.
홍반은 광범위한 질병에서 관찰되기 때문에,이 프로토콜에 따른 실험은 필드 특정입니다. 우리의 실험실에서, 우리는 멤브레인 생물학적 특성 및 나노 물질과의 멤브레인 상호 작용에 대한 홍안의 효과를 검사하는 데 관심이 있습니다. 홍변은 당뇨병, 겸상적혈구 빈혈 및 탈라세미를 포함한 많은 수의 질병과 관련이 있습니다.
홍안증을 유도하기위한 재현 가능한 프로토콜을 갖는 것은 각 필드에 특정 추가 과학적 질문을 조사하는 이 분야의 연구원을 도울 수 있습니다.
