SUMO 결합 체질은 생체 내에서 내인성 SUMOylated 단백질을 분리할 수 있게 합니다. 이것은 활성 SUMO 특정 protease의 존재와 생체 내의 SUMOylated 단백질의 낮은 분수 때문에 오히려 도전적입니다. SUMO 결합 엔티티를 이용하여 SUMO 결합 프로테오메의 분리는 SUMO 기판에 대한 전반적인 선호도의 증가를 연기하기 때문에 유리하다.
이것은 SUBEs가 변형된 단백질에 대한 구체적으로 SUMO 분자를 인식함으로써 SEM의 탠덤 반복을 포함하는 단백질에서 일반적이라는 사실에 기인합니다. 간암에서 SUMOylated 프로테오메의 격리 및 특성화를 위한 SUMO 결합 체체의 사용은 빠르고 민감한 방법입니다. 그것은 잠재적인 치료 접근에 있는 간암에 있는 SUMOylation 통로의 다소 알려지지 않은 역할에 과거 정보를 제공합니다.
SUMO 결합 체질은 인간 표본 및 동물 모델뿐만 아니라 여러 세포 모델에서 간 외에 다른 조직에서 SUMOylated 프로테아메를 분리하고 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 수행하기 쉽지만 동일한 유형의 여러 샘플을 분석할 때주의해야 합니다. 관련된 몇 가지 단계에 쿨러 큐브.
따라서 이 실험을 시작하기 전에 튜브를 조심스럽게 평준화하는 것이 좋습니다. SUMO 바인딩 엔터티의 사용의 시각적 데모는 특히 프로토콜 중에 비트를 처리하는 데 어려움과 재료 의 손실로 인해 이 프로토콜의 혁명을 용이하게 합니다. 인간 헤파종 세포는 이전에 접시 당 1.2 에서 150 만 세포의 밀도로 P100 플레이트의 세포를 도금하여 제조되었으며 섭씨 37도에서 표준 성장 매체에서 유지합니다.
세포를 사용할 준비가 되면 플레이트에서 미디어를 흡인하고 멸균 PBS5mm로 세척하십시오. 접시를 얼음 위에 놓고 원고 의 지시에 따라 보충 된 용해 버퍼 500 마이크로 리터를 추가하십시오. 그런 다음 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트 바닥에서 셀을 용해 매개체로 부드럽게 긁어냅니다.
또는 트립시화로 세포를 수확하고 트립신-EDTA 1밀리리터를 접시에 추가하여 세포가 덮여 있는지 확인합니다. 접시를 37도 인큐베이터에 넣고 접시에서 분리할 수 있도록 5분간 접시를 넣은 다음, 미리 따뜻해지는 성장 매체 의 2밀리리터를 추가하여 트립시니화를 중지합니다. 세포를 150배 G에서 10분 동안 원심분리하고 수퍼나티를 흡인시합니다.
그런 다음 PBS 및 원심분리기로 세포를 10 분 간 씻습니다. 수퍼내티퍼를 흡인하고 500 마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가합니다. 15000회 G와 섭씨 4도에서 10분간 리세세포를 원심분리한 다음, 수퍼네티츠를 신선한 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다.
수확 된 마우스 간을 사용할 준비가되면, 얼음 차가운 용해 버퍼의 한 밀리리터에 신선하거나 스냅 냉동 조각75 밀리그램을 균질화합니다. 원고 의 지시에 따라 균질화기를 실행합니다. 조직 균질화 후, 원심 분리시 시료를 15000 G와 섭씨 4도에서 10분 동안 분리합니다.
상체를 신선한 튜브로 옮기고 펠릿을 버리십시오. 비드 70 밀리그램에 이온화 된 물 1 밀리리터를 추가하고 4 개의 데그어 섭씨에서 하룻밤 동안 재구성하여 글루타티온 구슬을 준비하십시오. 부종 후, 비드를 10 밀리리터의 이온화 물 또는 PBS로 세 번 씻고, 매 씻은 후 5 분 동안 300 회 G에서 원심 분리하십시오.
세차 후, PBS의 1 밀리리터에서 구슬을 다시 분리하여 100 마이크로그램의 GST-SUBEs 또는 GST 제어에서 각 샘플에 대해 50%의 슬러리를 얻어 글루타티온 비드 슬러리 100마이크로리터및 PBS의 500 마이크로리터로 한다. 회전하는 동안 적어도 2 시간 동안 섭씨 4도에서 혼합물을 배양 한 다음 5 분 동안 300 회 G에서 원심 분리로 구슬을 회수하고 PBS에서 다시 중단하십시오. 이전에 준비된 셀 용액의 10%를 3배 의 동일한 부피로 희석하십시오.
글루타티온 비드 슬러리의 100 마이크로 리터에 정제 된 용액의 450 마이크로 리터를 추가합니다. 천천히 회전하는 동안 적어도 2 시간 동안 4 섭씨에서 구슬로 lysate을 배양하십시오. 인큐베이션 후, 5 분 동안 300 회 G에서 구슬을 스핀다운하고 분석을 위해 상퍼를 수집합니다.
총 부피의 10%를 별도의 튜브로 옮기고 동일한 부피를 3배 의 끓는 버퍼를 추가합니다. 05%Tween 20으로 얼음 차가운 PBS 1밀리리터를 추가하고 1분 동안 섭씨 300회, 섭씨 4도로 회전하여 나머지 샘플을 세 번 씻으시면 됩니다. 액체가 남아 있지 않도록 슈퍼네티드를 조심스럽게 흡인합니다.
그런 다음 3X 끓는 버퍼의 15 마이크로 리터와 15 개의 용해 버퍼로 샘플을 엘테합니다. 원고 방향에 따라 서부 얼룩 분석을 실행합니다. 질량 분석법을 수행하는 경우, 단계 팁 C18 마이크로컬럼을 사용하여 펩티드를 염화하고 분석 전에 0.1%의 포믹산으로 재보종한다.
샘플을 LC-MS 시스템에 로드하고 트리플리케이트로 분석합니다. 관련 소프트웨어를 사용하여 단백질 식별 및 풍부한 계산을 진행합니다. 원고 방향에 따라 통계 분석을 수행합니다.
이 프로토콜은 간암과 야생 형 쓰레기종의 자발적인 발달을 일으키는 글리신 N-메틸 트랜스퍼라아제 결핍으로 마우스에서 SUMOylated 단백질을 분리하는 데 사용되었습니다. Ponceau S 염색은 SUBEs 풀다운 분석기에서 입력, 흐름 스루 및 바운드 분획에서 수행되었다. SUBEs로 포획된 LKB1의 서양 얼룩 분석은 LKB1 SUMOylation의 수준이 간 종양에서 증강된다는 것을 보여줍니다.
인간 간종 세포와 비 변형 간 상피 세포는 자연스럽게 SUMOylated 단백질과 상호 작용하는 SUMO-trap의 용량을 조사하기 위하여 이용되었습니다. 첫째, 종래의 단백질 염색은 SUBEs로 포획된 총 물질을 시각화하는 데 사용되었다. 이어서 질량-분광법은 742개의 단백질이 간종 세포 SUBEs 샘플에서 농축되었고 577은 간 상피 비변형 세포 SUBEs 샘플에서 농축되었다는 것을 보여주었다.
SUBE실험을 수행할 때, 수모이터의 순도를 유지하기 위해 세포와 조직을 얼음에 유지하고 리시스 버퍼에 특정 밀리리터를 추가하는 것이 중요합니다. SUBEs를 사용하여 SUMOylated 프로테오메를 시각화한 후, 우리는 서양 얼룩 분석 또는 질량 분석법을 사용하여 특성을 찾을 수 있습니다. SUBE의 적용은 간암 조직 및 간종 세포에서 SUMOylated 프로테아메를 분리하고 특성화하여 잠재적인 치료 메커니즘을 제공할 수 있는 간암에서 SUMO의 번역 후 변형의 역할을 탐구하는 길을 열어가고 있다.
