이 프로토콜은 C.Elegans를 동원하여 신체 벽 근육의 생체 내 칼슘 이미징을 수행하는 두 가지 방법을 제공합니다. 이 방법은 칼슘 항상성 및 칼슘 취급과 관련된 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있으며 유전적 인 유분 성 유기체에서 접근 할 수있는 시냅스입니다. 이 기술은 근육 칼슘 항상성을 조절하는 메커니즘의 더 나은 이해를 제공 할 수 있으며, 따라서 칼슘 사이클링의 오조절을 통해 흥분 수축 커플링에 영향을 미치는 조건이나 분자 경로를 식별하는 데 중요 할 수 있습니다.
이러한 방법은 신경생물학, 발달 생물학 및 세포 생물학을 포함하되 이에 국한되지 않는 연구 분야에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 세포 모형 및 C.elegans, 그밖 관련 선충 뿐만 아니라 오물 지방 애벌레를 공부하기 위하여 적응될 수 있었습니다. 이 방법의 시각적 데모는 실험자가 해부 기술을 이해하고 제대로 고정 된 동물로부터 칼슘 과도를 정확하게 평가 할 수 있도록 중요합니다.
형광 화상 진찰을 위한 현미경을 설치하여 시작합니다. 칼슘 수준의 급격한 변화를 추적하기 위해 100 헤르츠에서 풀 프레임 이미징이 가능한 과학 CMOS 카메라를 사용하십시오. ImageJ에서 실행되는 마이크로 매니저 소프트웨어로 카메라 수집 및 LED 형광 내분 등을 제어합니다.
외부 오픈소스 마이크로 컨트롤러 보드에 연결되는 오픈소스 전자 플랫폼 플러그인을 사용하여 형광 내문을 제어하는 외부 타이밍 펄스를 관리합니다. 타이밍 논리를 제어하려면 제조업체 지침에 따라 소프트웨어의 마이크로관리자 획득 프로토콜을 활성화합니다. 두 개의 LED를 사용하여 청색광으로 채널 진도신을 자극하고 RCaMP 변경 사항을 기록합니다.
470나노미터의 피크 입장 파장과 밴드패스 필터로 am LED로 채널 진도신을 활성화하고, 594나노미터의 피크 입장 파장과 밴드패스 필터로 LED로 RCaMP를 자극한다. LED를 모두 공동 조명하고 디크로이크 빔 결합기를 사용하여 동일한 광학 경로로 빛을 전달합니다. 원고 방향에 따라 TTL 신호에 의해 제어되는 솔리드 스테이트 스위치로 LED 조명의 타이밍을 제어하고 전류 제어 부하 노이즈 선형 전원 공급 장치로 LED 강도를 설정한 다음 블루라이트 시뮬레이션 프로토콜을 시뮬레이터로 프로그래밍합니다.
이 실험에서는 RCaMP 형광만을 캡처한 후 2초 후에 청색광 시뮬레이션을 켜고 50밀리초 간격으로 5밀리초 의 블루 라이트 펄스를 사용하여 채널 로도신을 활성화합니다. 해부 준비를 사용하는 경우 저조도에서 C.elegans 해부를 수행합니다. 원고 의 지시에 따라 준비 된 칼슘 세포 외 용액의 1 밀리몰로 채워진 실리콘 코팅 커버 슬립 베이스와 해부 접시에 동물을 배치합니다.
벌레의 등쪽을 따라 파란색 색칠과 액체 국소 피부 접착제를 사용하여 동물을 접착제. 그리고 유리 바늘을 사용하여 접착제와 웜 인터페이스를 따라 측면 큐티클 절개를합니다. 입 파이펫을 사용하여 웜 캐비티에서 내부 내장을 제거한 다음 동물의 큐티클 플랩을 아래로 접착제하여 이미징을 위해 복부 내측 내측 신체 벽 근육을 노출시하십시오.
나노 비드 제제를 사용하는 경우 증류수를 사용하여 100 밀리리터의 최종 부피에 용융 된 5 % 아그라 용액을 만듭니다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 용융 아그라 용액한 한 방울을 유리 슬라이드에 놓고 부드럽게 압력을 사용하여 두 번째 유리 슬라이드를 상단에 놓고 아그라의 패드를 만듭니다. 상단 슬라이드와 패드 의 중간에 폴리스티렌 나노 구슬의 약 4 마이크로 리터에서 제거합니다.
저조도에서 나노 비즈 솔루션에 4~6개의 C.elegans를 추가하여 동물이 서로 위에 놓이지 않도록 하고 조심스럽게 표지슬립을 위에 놓습니다. 이미지 할 준비가되면, 현미경에 준비 된 슬라이드 또는 해부 접시를 배치하고 찾아 10 배율과 희미한 밝은 필드 조명을 사용하여 벌레에 초점을 맞춥니다. RCaMP 형광 내분 내분에서 60배 배율로 전환하여 외음부와 올바른 보컬 평면에 전방인 벤트럼 내측 체벽 근육을 식별합니다.
그런 다음 토글을 꺼내 데이터 수집 소프트웨어 내에서 라이브를 클릭하여 접피스에서 카메라로 이미지 경로를 변경합니다. 데이터 수집 소프트웨어의 ORI 버튼을 클릭하고 초점을 맞추고 있는 근육 주위에 상자를 만듭니다. 자극기에서 이전에 프로그래밍된 청색 광 자극 경로를 켜고 이미징 소프트웨어 획득을 클릭하여 이미지를 캡처합니다.
C.elegans가 모든 트랜스 망막에서 재배되면 망막을 성공적으로 통합하고 채널 rhodopsin을 활성화하면 칼슘 과도를 불러 불러 올릴 수 있습니다. 동물이 모든 트랜스 망막에 노출되지 않으면 근육 칼슘 과도가 트리거되지 않습니다. 이 프로토콜은 sca-1 유전자에 의해 인코딩된 석관 망상 칼슘 펌프에 영향을 미치는 기능 sca-1 돌연변이의 손실을 조사하는 데 사용되었다.
그러나, RCaMP 형광의 기준선 수준에서 해부 준비 증가는 대조군과 비교하여 돌연변이에서 관찰되었으며, 이는 돌연변이가 휴식 세포질 칼슘의 높은 수준을 필요로 한다는 것을 시사한다. 대조군과 비교하여 sca-1 돌연변이체에서 피크 칼슘 수치가 현저하게 감소했습니다. 그러나 상승된 피크 시간 이나 반 부패 시간에는 변화가 없었습니다.
중요한 것은, 기술적으로 덜 도전적인 나노 비드 제제를 사용하여 유사한 결과를 관찰할 수 있다. 기능 슬로 돌연변이의 손실, 이는 칼슘 활성화 큰 칼륨 채널을 방해 C.elegans에서 칼슘 취급에 간접적으로 영향을 미치는 돌연변이를 조사하기 위해 평가되었다. RCaMP의 기준선 수준을 측정했을 때 돌연변이체는 대조군에 비해 형광이 증가하여 표시되었다.
칼슘의 운동학을 평가할 때, 칼슘 수치가 급격하게 변하지 않았다. 그러나 슬로-1(eg142) 돌연변이체는 피크 타임으로 크게 증가했습니다. 절차를 완료 할 때 기억해야 할 가장 중요한 단계는 모든 트랜스 망막에서 실험 동물을 준비하는 것입니다.
이 단계없이 채널 rhodopsin은 비활성 될 것입니다, 발동되는 빛 유도 칼슘 과도를 방지. 이 절차에 따라, 전기 생리학 및 행동 분석은 칼슘 항상성에 있는 어떤 관찰된 변경의 기능적인 충격을 평가하기 위하여 행해질 수 있습니다. 여기에 설명된 고정 방법을 사용하여 칼슘 역학을 추가로 탐사할 수 있는 길을 열어주며, 훨씬 덜 도전적인 비드 고정 기술을 사용하여 광유전학 신경 자극및 근육 칼슘 과도의 캡처에 대응하여 유사한 결과를 관찰할 수 있음을 보여줍니다.
