이 방법은 막 단백질에 얼룩을 두는 동시에 막 무결성 및 세포 전 세이체 아키텍처를 보존하는 기능을 결합합니다. 따라서 멤브레인 관련 단백질을 정확하게 국소화하는 데 매우 강력합니다. 이 기술의 주요 장점은 견고한 유전 적 복제 태그, APEX2의 사용과 극저온 및 동결 대체를 포함한 전자 현미경 검사법을 위한 세포 보존에 있는 기술 방법의 상태를 결합한다는 것입니다.
이들은 함께 잘 보존된 세포 내에서 정확한 단백질 국소화를 허용합니다. 이 프로토콜은 바이러스가 호스트 셀 내부에서 복제되는 메커니즘을 해부하는 데 사용할 수 있습니다. 바이러스는 수시로 그들의 감염 계획 도중 호스트 단백질을 납치할 것입니다.
바이러스는 작은 게놈, 그들은 이러한 호스트 세포 내부 복제 활용. 최근, 우리는 게시되지 않은 데이터에서 바이러스가 복제하는 방법을 이해하기 위해이 기술을 사용하여 이러한 단백질을 라벨 수 있었습니다. 이 기술은 골기 고장을 일으키는 원인이 되는 세균성 독소에 최근 협력 연구에서 정말 중요한 입증했습니다.
cryoAPEX를 사용하여, 우리는 단편화된 골기 조각으로 독소를 정확하게 현지화할 수 있었습니다, 일반적인 면역 형광 기술을 사용하여 그렇지 않으면 보기 가 정말 어려웠던 무언가. 이 기술을 시연하는 것은 대학원생인 일레인 미헬크(Elaine Mihelc)와 연구 동료인 스테파니 엔젤(Stephanie Angel)이 우리의 실험실에서 볼 수 있습니다. 접시에 HEK293 세포를 파종 한 후, APEX2 태그 포유류 발 플라스미드 제조업체의 지시에 따라 트랜스 페시언 시약을 사용하여 세포를 트랜스펙트.
12-15 시간 후에 경질 후에, PBS로 한 번 세포를 씻는다. 그런 다음 접시에서 PBS로 세포를 15 밀리리터 원내 튜브로 씻어냅니다. 500 x g의 원심분리기는 5분간.
상체를 조심스럽게 제거하고 실온에서 pH 7.4에서 2%의 글루타랄데히드 및 0.1 어금니 나트륨 카코딜레이트 버퍼의 2밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 샘플을 얼음 위에 놓고 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 5분간 500 x g로 펠릿합니다.
펠릿을 각각 5분간 3회 세척하여 0.1 의 어금니 나트륨 카코디레이트 버퍼 2밀리리터를 섭씨 4도에서 원심분리하여 씻습니다. 원심 분리 후 상체를 제거합니다. peroxidase 반응을 수행하기 위해, 5 분 동안 500 x g에서 펠릿팅 다음 DAB 용액의 3 밀리리터에서 다시 중단하여 펠릿을 세척합니다.
그런 다음 과산화수소 5.88 밀리머를 가진 DAB 용액 의 3 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 실온에서 30분 동안 배양하세요. 펠릿은 눈에 띄게 갈색으로 되어 불용성 DAB 반응 생성물의 존재를 나타냅니다.
DMEM에서 나트륨 cacodylate 버퍼로 다시 세척 한 후 원고에 따르면 10 %의 태아 소 혈청과 15 %의 소 세럼 알부민을 포함하는 DMEM의 냉동 보호 용액 500 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 세포 현탁액을 0.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 이송한다. 펠릿은 다시 원심분리기 속도를 500 x g에서 약간 증가시킵니다.
펠릿이 건조하지 않도록 충분한 액체가 남아 있는지 확인, 상체의 대부분을 폐기. 실험실 닦아 또는 종이 타월의 모서리를 사용하여 세포 펠릿에서 남은 액체를 멀리 심지. 펠릿이 치약과 일관성이 유사하여 페이스트를 형성하는 충분한 액체를 유지하게 하십시오.
세포 펠릿의 2~3개의 마이크로리터를 흡인시키고 멤브레인 캐리어에 증착한다. 표면 장력이 상단에 약간의 돔을 만들 수 있도록 멤브레인 캐리어의 우물을 완전히 채웁니다. 멤브레인 캐리어를 카트리지에 밀어 넣고 고정합니다.
카트리지를 준비 및 준비된 HPF 기계에 넣고 누기 시작하십시오. 카트리지를 액체 질소에 담그고 카트리지에서 멤브레인 캐리어를 제거합니다. 플라스틱 캡슐에 넣고 플라스틱 캡슐을 액체 질소로 가득 찬 극한의 극찬에 넣습니다.
화학 후드에서, 부피 탄닌산에 의해 0.2 %의 무게와 극저온아의 아세톤에 5 %의 DI 물용액의 샘플 당 1 밀리리터를 준비합니다. 동결액체 질소에 넣습니다. 동결 대체 믹스 1개의 바이알과 냉동 셀 펠릿을 함유한 Cryovials를 동결 대체 단위 샘플 챔버에 놓습니다.
액체 질소 유리병으로부터 멤브레인 캐리어를 함유한 내부 캡슐을 동결 대체 믹스 를 함유한 해당 바이알로 옮춥시킵니다. 섭씨 90도에서 동결 대체 프로토콜을 시작합니다. 24시간 후 동결 대체를 일시 중지하고 90°C까지 냉각된 아세톤으로 5분간 샘플을 세 번 세척합니다.
다음으로, 화학 후드에서, 1 %의 오스뮴 테트산화물의 용액의 샘플 당 1 밀리리터를 준비하고, 0.2 % 우란 아세테이트, 및 냉동 액체 질소에 넣어 아세톤에 5 %의 DI 물을 배치합니다. 동결 대체 믹스2를 동결 대체 장치에 넣고 3차 아세톤 세척에서 캡슐을 동결 대체 믹스 2개 바이알로 옮춥시다. 이를 배양하고 교체 믹스를 섭씨 90도에서 72시간 동안 동결한 다음 12-18시간 동안 섭씨 0도까지 점진적으로 온난화됩니다.
온도를 섭씨 0도에서 유지하고 미리 냉각된 아세톤을 바이알에 추가하여 각각 10분 동안 세 번 세척합니다. 제조업체의 지시에 따라 플라스틱 비커에 수지 혼합물을 준비하고 캡슐을 몰입시키기 위해 바이알에 2 %4 %와 8 %의 수지 (수지)를 추가하십시오. 섭씨 0도에서 각각 2시간 동안 배양하세요.
그런 다음 A, B, D의 15%30%60%와 100% 수지 성분을 실온에서 각각 4시간 동안만 배양합니다. 20시간 후 수지 성분 A, B, C 및 D를 혼합하여 4시간 동안 배양합니다. 세포 펠릿 이면에 세포 펠릿을 얹고 수지 혼합물 A, B, C 및 D.를 오븐에 넣고 24-36 시간 동안 60도에서 중합합니다.
중합 후, 금형에서 블록을 제거하고 배율로 시각화 할 수있는 초미세 토메의 수직 척에 샘플을 배치합니다. 멤브레인 캐리어에 액체 질소를 두드리는 조합으로 멤브레인 캐리어를 분리하여 금속을 플라스틱으로부터 분리하고, 면도날을 사용하여 멤브레인 캐리어 주변의 수지를 제거합니다. 분리하면 멤브레인 캐리어를 부드럽게 들어 올려 세포 펠릿 돔을 블록 의 얼굴에 남깁니다.
노출된 셀 펠릿이 첫 번째 금형보다 약간 더 깊은 평평한 임베딩 몰드에 위쪽으로 향하는 블록을 놓고 수지 성분 A, B, C 및 D.폴리머를 섭씨 60도에서 24-36시간 동안 채웁니다. 면도날을 사용하여 셀 펠릿 주변의 블록을 다듬습니다. 그런 다음 초미세 토메의 단면 암에 샘플 척에 블록을 놓습니다.
유리 나 다이아몬드 나이프를 사용하여, 밀접하게 세포 펠릿을 둘러싼 사다리꼴 모양으로 블록을 손질. 유리 또는 다이아몬드 나이프를 사용하여 세포 펠릿의 90 나노미터 초박면을 가져옵니다. TEM 그리드에서 섹션 리본을 선택합니다.
필터 용지에 가장자리를 블로팅하여 그리드를 건조시키고 TEM 그리드 저장 상자에 보관합니다. TEM 홀더에 그리드를 마운트하고 현미경에 홀더를 배치합니다. 80킬로볼트에서 Tecnai T12를 사용하여 극저온APEX 샘플을 검사하십시오.
APEX2 라벨링으로 관심 있는 세포 및 세포 극체 구조의 이미지를 획득합니다. 이 연구에서는, 전통적인 APEX 방법에 의한 견본의 준비는 조직되고 매끄러운 풍요로운 망상 구조물의 명확한 표시 귀착되었습니다. 높은 배율에서, 쌓인 막은 주름이 나타났고 동심 막 밀도 사이에 부균일한 간격이 존재하여 막 보존과 지질 추출이 불량했음을 나타냅니다.
cryoAPEX에 의해 제조된 견본은 또한 조직되고 매끄러운 폐막 구조물의 명확하게 정의된 표시가 있었습니다, 그러나, 막은 매끄럽고 평행하고 거의 또는 전혀 지질 추출이 보였다. 90 나노미터 의 얇은 섹션의 TEM 분석은 헌팅턴 효모 상호 작용 단백질 E가 핵 봉투뿐만 아니라 말초 내피 성 망상 전체에 존재했다는 것을 밝혔다. 또한, 헌팅턴 효모 상호 작용 단백질 E 밀도는 발등 풍안성 망상 막을 따라 정기적으로 간격이 있는 초점으로 해결되었다.
헌팅턴 효모 상호 작용 단백질 E 분포 및 포시는 또한 전통적인 고정 및 탈수로 제조된 견본에서 보였습니다. 그러나 광범위한 막 중단 및 추출이 존재하여 시료를 최적이 지않았다. APEX2 라벨링은 3개의 세포 마커를 사용하여 수행되었으며, 그 중 미토-V5-APEX2는 미토콘드리아만의 특정 염색을 제공했으며 CAAX-APEX2는 플라즈마 멤브레인의 뚜렷한 염색만을 생성하였다.
세포 내 세포기관에서는 라벨이 관찰되지 않았습니다. 골지 루멘에 대한 염색은 또한 우리의 원래 Sengupta 외 원고에 설명된 바와 같이 알파 MAN2-APEX2 마커를 사용하여 평가되었다. 이 절차에 이어, 전자 단층 촬영 또는 집중 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 검사와 같은 3차원 방법은 관심 있는 단백질의 3D 분포를 조사하기 위해 수행될 수 있다.
이 프로토콜에 사용되는 화학 물질의 대부분은 독성, 그래서 사용하기 전에, 안전 데이터 시트는 화학 물질이 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 처리되고 기관 지침에 따라 폐기되도록 협의되어야한다.
