다공성 시스템에서 박테리아의 수송을 공부하는 것은 오염에 관하여 중요합니다, 질병의 퍼짐, 및 biore중개. 단일 세포에서 작동하는 수학적 모델에서 이러한 실험을 위해서는 인구와 미생물 커뮤니티 수준이 필요합니다. 여기서 우리는 미세 유체 장치 및 현미경 검사법을 사용하여 세균 수송을 연구하는 도구뿐만 아니라 유동 세포측정과 함께 더 큰 장치를 제시합니다.
미세 유체 장치와 미세 한 장치와 미세 한 세포 측정 의 조합은 다른 공간 비늘에서 세균 수송 현상을 연구 할 수있는 다양한 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜을 완전히 탐구하기 위해 현미경 검사법, 기본 이미지 처리, 미세 유체 장치 설계 및 유동 세포 측정 을 마스터하는 이전의 경험을 갖는 것이 좋습니다. 이 비디오는 다른 공간 비늘에서 세균 수송을 연구하는 두 가지 방법을 설명합니다.
미세 유체 장치를 기반으로 하는 첫 번째 방법은 현미경 검사법에 의존하여 개별 세포를 계산합니다. 이 시스템은 전체 다공성 시스템 규모에 공공에서 여러 공간 비늘에 걸쳐 세균 수송을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 두 번째 방법은 자동화된 디스펜서 및 유동 세포측정에 결합된 더 큰 유체 장치를 사용하여 전체 다공성 시스템의 규모로 세균 수송 현상을 연구하는 데 사용될 수 있다.
이러한 방법은 실험실 규모의 컬럼 연구와 소규모 현장 조사에도 배포할 수 있습니다. 먼저 원 행렬로 구성된 원하는 다공성 형상을 디자인합니다. 선택한 형상을 기반으로 표준 SU-8 포토리소그래피를 사용하여 금형을 준비합니다.
깨끗한 일회용 용기에 무게로 엘라스토머의 90%에 화합제의 90%에 엘라스토머의 90%를 추가하고 두 시약을 깨끗한 공구와 혼합하여 50그램의 PDMS를 준비합니다. 용존 공기와 거품을 제거하기 위해 30 분 동안 100 밀리바의 진공을 적용합니다. 금형을 페트리 접시에 넣고 PDMS를 금형에 붓고 2~5밀리미터 사이의 원하는 높이로 붓습니다.
페트리 접시를 뚜껑으로 덮고 섭씨 60도에서 최소 4시간 동안 보관하십시오. 그 후, 미세 유체 장치가 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 냉각되면 메스로 PDMS의 원하는 부분을 조심스럽게 제거하십시오.
PDMS 채널의 바닥을 테이프로 일시적으로 밀봉합니다. 직경 0.5mm의 펀처로 채널을 관통하여 입구와 콘센트를 만듭니다. PDMS 채널에서 테이프를 제거하고 다공성 면이 위로 향하는 채널을 배치합니다.
유리 슬라이드와 PDMS 표면을 실온에서 각각 약 45초 동안 플라즈마로 처리합니다. 전처리 된 PDMS 채널을 전처리 된 유리 슬라이드에 놓고 뜨거운 접시에 30 분 동안 100도의 열에 놓고 뜨거운 플레이트에서 미세 유체 장치를 제거하고 실온으로 냉각하십시오. 30분간 진공을 적용하여 PDMS에서 공기를 제거합니다.
기공 구획을 포함하는 베이스를 생산하려면 고정밀 마이크로 밀링을 사용하여 기본 PMMA 층에서 0.5 밀리미터를 제거하고 고무 O 링의 경우 1.1 x 1.1 밀리미터 크기의 홈을 밀링하십시오. 입구와 출구를 위해 두 개의 나사 구멍을 뚫고 유체 장치의 상단 부분과 나사에 대한 12 구멍을 뚫습니다. 이것은 유체 장치의 뚜껑 역할을합니다.
유체 장치를 청소한 후 12개의 나사 구멍을 사용하여 베이스와 뚜껑을 함께 나사로 연결합니다. 진공에서 미세 유체를 제거하고 현미경 단계에 배치합니다. 주사기 펌프를 사용하여 운동성 버퍼로 포화시합니다.
브라이트필드 현미경 검사법 또는 위상 대비를 사용하여 배율을 조정하여 개별 세균 세포를 시각화하고 관찰 채널의 중심에 집중합니다. 광 경로 설정을 형광 현미경 검사법으로 전환합니다. 오프셋과 카메라 노출 시간을 통해 초점을 조정하여 개별 세균 세포를 해결합니다.
이 경우 100밀리초. 다음으로, 세균 현탁액을 포함하는 2 밀리리터 튜브에 입구 튜브를 삽입합니다. 펌프 방향을 반전하고 분당 1마이크로리터의 유속도로 서스펜션을 철회하기 시작합니다.
전체 관측 채널의 단면을 스캔하여 분마다 이미지를 기록합니다. 이미지를 원하는 소프트웨어 플랫폼으로 가져옵니다. 파티클이 기록되지 않았을 때 배경을 첫 번째 이미지의 평균으로 기록합니다.
각 이미지의 배경을 빼서 카메라 노이즈와 광학 수차를 제거합니다. 이미지를 관심 영역으로 자르는 것입니다. 임계값보다 큰 값이 세균 세포를 포함하도록 세포 형광 픽셀 강도와 동일한 임계값을 식별합니다.
이미지 처리를 사용하여 각 그림에서 임계값값을 뺍니다. 결과 이미지를 비나이즈하여 박테리아 세포가 하나의 값을 차지하지만 배경은 0의 값을 차지합니다. 픽셀에서 가장 작은 세균 세포 크기보다 작은 영역으로 픽셀 클러스터를 제거합니다.
바이나화된 이미지를 합하여 나머지 클러스터의 총 픽셀 수를 가져옵니다. 픽셀 수를 픽셀 단위로 나누어 셀 수의 추정치를 얻습니다. 밀리리터당 입자의 농도로 카운트를 변환합니다.
주입된 세균 현탁액의 농도를 식별하려면 주사기가 있는 깨끗한 미세 유체 장치의 관찰 채널에 세균 현탁액을 주입하십시오. 이미지를 기록하고 이전에 표시된 대로 인부유성 세균 농도를 계산합니다. 유천성 세균 농도 C0로 유출세균 농도 C를 정상화하고 C0 을 통해 C를 시간 동안 플로팅하여 획기적인 곡선을 시각화한다.
다공성 매트릭스를 통해 수송되는 박테리아의 국소 속도 및 궤적을 분석하기 위해 현미경 단계를 관심 영역으로 이동하고 미세 유체 장치의 중심으로 초점을 조정한다. 광학 구성을 위상 대비 또는 형광 현미경검사로 설정합니다. 시간 경과 이미지와 노출 시간을 충분히 짧게 기록하여 세균 변위를 포착합니다.
이 경우 50밀리초입니다. 예를 들어 3분 동안 충분한 시간 동안 사진을 기록합니다. 각 이미지에서 노이즈를 제거하려면 기록된 모든 이미지의 평균인 배경을 뺍니다.
숫자 그라데이션의 계수를 결정하고 최대 값으로 정규화합니다. 세균 좌표및 이미지 수집 시간을 3열 파일로 찾아 기록합니다. 파티클 추적 분석을 수행하여 기록된 데이터를 처리하고 궤적을 계산합니다.
증착 프로파일을 얻으려면, 전 전체 다공성 채널의 복합 이미지를 기록하였고, 이는 미세유체 장치를 통해 세균현탁액의 배경및 주입 후이다. 세균 주사 후 기록 된 이미지에서 배경을 제거합니다. 증착 프로파일 D를 다공성 채널의 길이 x의 횡단 구간을 따라 세균형 형광 신호의 합으로 계산한다.
증착 프로파일을 다공성 채널 길이 에 비해 국소 형광 신호로 시각화합니다. 자동 디스펜서를 설정하려면 로봇 디스펜서를 유체 장치 가까이에 두는 다. 로봇 디스펜서를 BCNC를 실행하는 컴퓨터에 연결하고 올바른 컴 포트를 식별합니다.
BCNC에서 홈 버튼을 클릭하여 로봇 디스펜서를 홈 위치로 반환합니다. 연동 펌프를 50cm 길이, 1mm 내경 튜브, 동일한 튜브를 사용하는 자동 디스펜서와 유출을 사용하여 입구와 연결합니다. 유체 장치를 통해 배양 배지를 펌핑합니다.
로봇 디스펜서에 고정된 콘센트 튜브에 매체가 도착하여 유출을 수집하는 96웰 플레이트를 배치합니다. 동시에, 로봇 디스펜서를 활성화하고 분당 0.2 밀리리터의 유량으로 PMMA 유체 장치를 통해 세균 현탁액을 주입한다. 여러 모공 볼륨에 해당하는 세균 현탁액을 주입하십시오.
예를 들어, 유체 장치의 30 배 부피. 주사 후, 실험이 끝날 때까지 멸균 재배 배지로 전환한다. 96웰 플레이트가 완성되면 플레이트를 덮고 혈류 세포 분석이 될 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오.
유동 세포측정을 사용하여 샘플을 분석하고 유입성 세균 농도 C0을 정상화하고 C0 대 시간 동안 C를 플로팅하여 획기적인 곡선을 시각화합니다. 본 연구에서는, 모틸및 비운동성 슈도모나스 푸티다 KT2440을 모두 사용하여, 임의의 기둥 배열을 가진 PDMS 미세유체 장치에서 순차적인 실험을 수행하였다. 분공 스케일의 세균 궤적뿐만 아니라 주입된 세포의 농도로 정규화된 획기적인 곡선이 여기에 나와 있다.
PMMA에서 분쇄된 대규모 유체 장치를 위한 실험도 수행하였다. 모틸및비운동성 슈도모나스 푸티다 KT2440은 정기적으로 이격된 다공성 매트릭스에 주입되었다. 놀랍게도, 생물막이 없는 다공성 환경에서, 모틸및 비운동성 슈도모나스 푸티다 KT2440은 획기적인 곡선을 기반으로 현저하게 다른 운송 동작을 보였다.
복잡한 스트림 생물막 커뮤니티와 함께 48시간 동안 식민지화된 다공성 매트릭스에서, 모틸과 비운동성 슈도모나스 푸티다 KT2440 사이의 획기적인 곡선의 차이는 사라졌다. 우리는 이 시스템을 사용하여 스트림에서 세균 수송을 연구하지만, 이러한 도구는 다른 엔지니어링 및 환경 시스템에서 세균 수송 현상을 연구하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다. 수화 다공성 매체를 통한 세균 성 수송은 여러 공간 저울을 통해 공정을 캡슐화합니다.
여기서 제시된 방법론은 전체 다공성 매체에서 미세한 수송에 게 모공 규모에 박테리아의 국소 변위를 연결할 수 있습니다.
