A. Ozcan는 굉장히 과학자와 기술자에 대한 대통령 조기 직업 상 (PECASE)의 지원을 인정 육군 연구 사무소 (ARO) 젊은 연구자 상, 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (NSF) 경력 상, 해군 연구 사무소 (ONR) 젊은 연구자 상 보건 국립 연구소 (NIH) 이사, 보건 국립 연구소의 사무실에서 감독의 새로운 혁신 상 DP2OD006427.

이 섹션에서는, 우리는 휴대 전화 바탕으로 폭 넓은 분야 형광 현미경 13 광학 유체 이미징 세포 계측법 플랫폼 14 실험 프로토콜을 소개합니다. 우리는이 이미징 플랫폼을 테스트하기 위해 형광 구슬과 휘황 표시 백혈구를 사용합니다. 휴대 전화의 A. 준비는 와이드 필드 형광 현미경 및 광 유체 이미징 흐름 Cytometer를 바탕으로 카메라 폰 및 첨부 파일 추가에 소형 광학 유체 : 휴대 전화 바탕으로 폭 넓은 분야 형광 현미경이나 흐름 cytometer는 두 가지 주요 부분으로 구성되어 있습니다. 1. 카메라 폰 발표 기술은 거의 모든 카메라 폰에 적용하는 동안, 우리는이 장치에 대한 거점으로 소니 에릭슨 Aino를 선택했다. 이 휴대 전화에 설치 ~ 8 메가 픽셀 RGB CMOS 센서와의 초점 거리 (F 1) ~ 4.65 mm가 내장 된 렌즈가 있습니다. </p&gt; 2. 와이드 필드 형광 현미경을위한 광 유체 첨부 파일 광학 첨부 파일은 오토 데스크가 설계되어 있으며 ABSplus 열가소성 소재를 사용하여 3-D 프린터 치수 엘리트에 의해 인쇄됩니다. 이 인쇄 과정에서, 모델 및 지원 자료는 프린터에서 압출 머리에 가열하고 모델링베이스 층에 층을 증착하고 있습니다. 이 단계가 완료되면 지원 자료는 당사의 광학 첨부 파일 디자인 LED가 (~ 470 nm의 센터 파장 Digikey), 플라스틱 필터 (# NT54-46, 에드먼드로 구성되어 원하는 프로토 타입의 강력한 3D 모델을 떠나지, 용해 할 수 있습니다 광학), 샘플 트레이 및 평철의 렌즈 F 2 = 15mm (# NT45-302, 에드먼드 광학). 모든 LED 및 플라스틱 필터는 쉽게 fluorophores &#39;스펙트럼에 따라 변경 될 수 있습니다. 이 광학 유체 첨부 파일을 조립하는 단계는 다음과 같습니다 : <ol><li> 그 구체적인 렌즈 홀더 위치에서 첨부 파일에 렌즈를 배치합니다. </li><li> 필터 트레이에 플라스틱 필터를 놓고 첨부 파일에 밀어, 또는 테이프 휴대폰 카메라 렌즈 앞의 플라스틱 필터입니다. </li><li> 첨부 파일에 LED 트레이를 삽입합니다. </li><li> 샘플 트레이에 샘플 유리 슬라이드를 놓습니다. 첨부 파일에 샘플 트레이를 밀어 넣습니다. 샘플을 향해 LED를 직면하고 있습니다. </li><li> 추가 렌즈가 직접 휴대폰 카메라 렌즈와 연락 있다는 등의 휴대 전화에 첨부 파일을 클립. </li><li> LED가 켜 첨부 파일에있는 스위치를 사용합니다. </li><li> 는 &quot;야간 모드&quot;를 사용하여 휴대 전화 카메라 유닛과 관심의 이미지 샘플을. </li></ol> 3. 형광 이미징 세포 계측법을위한 광 유체 첨부 파일 희귀 한 사건의 검출을위한 액체 샘플의 큰 볼륨을 화면에 필요가있는 경우, optofluidic 유동 세포 계측법 장치가 선호 될 수 있습니다. 우리는 우리의 폭 넓은 분야 형광 현미경 디자인을 수정하고 흐름 cytometer, w로 변환 할 수 있습니다여기에 PDMS 기반의 마이크로 유체 채널이 지속적으로 이미징 볼륨을 통해 액체 샘플을 제공하는 데 사용됩니다. 광학 첨부 파일은 오토 데스크가 설계하고 크기가 엘리트 3-D 프린터를 인쇄합니다. 또한 LED가 (~ 470 nm의에서 중심 파장, Digikey), 플라스틱 필터 (# NT54-46, 에드먼드 광학), 샘플 트레이, 그리고 비구면 렌즈 (F = 4.5 mm) (제품 # C230TME-A로 구성되어 있습니다; Thorlab). 이 광학 유체 첨부 파일을 조립하는 단계는 다음과 같습니다 : <ol><li> 첨부 파일에 비구면 렌즈를 배치합니다. </li><li> 필터 트레이에 플라스틱 필터를 놓고 첨부 파일에 밀어, 또는 테이프 휴대 전화 카메라 렌즈 앞의 플라스틱 필터입니다. </li><li> 같은 광학 유체 첨부 파일에 마이크로 유체 채널을 밀어 넣습니다. </li><li> 추가 렌즈가 직접 휴대폰 카메라 렌즈와 연락 있다는 등의 휴대 전화에 첨부 파일을 클립. </li><li> LED가 켜 첨부 파일에있는 스위치를 사용합니다. </li><li> microfluid를 연결IC는 주사기 펌프에 채널 및 일정한 유량의 마이크로 유체 장치에 액체 샘플을 제공합니다. </li><li> 형광 셀 / 휴대폰 카메라의 비디오 모드를 사용하여 마이크로 유체 채널을 통해 흐르는 입자의 동영상을 캡처합니다. </li></ol> B. 샘플 준비 4. 형광 마이크로 입자 샘플의 작성 <ol><li> 10 μm 직경 (: 제품 # F8834 여기 / 580nm/605nm 방출, 녹색 구슬 : 빨강 구슬 제품 # F8836 : 여기 / 방출 505nm/515nm)과 형광 구슬은 Invitrogen (Carlsbad, CA)에서 구입하고 있습니다. </li><li> 녹색 형광 구슬, DI 물을 40 μl와 붉은 색 형광 구슬의 10 μl 10 μl를 섞는다. </li><li> micropipette와 샌드위치 구조를 만들기 위해 그것의 상단에 다른 유리 덮개를 씌우고을 사용하여 유리 슬라이드에이 구슬 혼합물의 Place10 μl. </li><li> 샘플 작업 표시 줄에이 샌드위치 구조를 삽입하고 휴대 전화의 첨부 파일에 밀어. </li&gt; </ol> 5. 휘황 레이블 화이트 혈액 세포의 준비 <ol><li> SYTO16 핵산 형광 라벨 키트 (# S7578, 생명 기술)와 인산을 생리 (PBS)는 냉장고에서 아웃 버퍼와 실내 온도로 방문을 유도 할 수 있습니다. </li><li> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 혈액 수집 관에서 1.5 ML의 폴리스티렌 튜브 (# 05-408-129, 피셔 과학)에 200 μl 전체 혈액 샘플을 전송합니다. </li><li> 철저하게 200 μl 전체 혈액 샘플과 믹스에 (# R7757, 시그마 - 알드리치) 1 ML 적혈구 lysing 버퍼를 추가합니다. </li><li> 5 분 후, lysed 혈액 샘플을 원심 분리기하고 표면에 뜨는 솔루션을 제거합니다. </li><li> 200 μl PBS 버퍼로 백혈구 세포 펠렛을 Resuspend하고 부드럽게을 섞는다. </li><li> 흰색 혈액 세포 샘플 5 μl 1 ㎜ SYTO16 솔루션을 추가 할 수 있습니다. ~ 30 분에 대한 어두운 환경에서 알루미늄 호일 및 배양과 샘플을 넣어. </li><li> 다시 샘플을 원심 분리기. 표면에 뜨는이 제거되고 분류 백혈구 세포 펠렛을 다시합니다PBS 버퍼로 - 일시 중지되었습니다. </li><li> 커버 슬립에 흰색 혈액 세포 액체 샘플을 표시 5-10 μl를 배치하고, 표본의 상단에 두 번째 커버 슬립을 배치합니다. </li><li> 샘플 작업 표시 줄 및 이미지를 휴대 전화 형광 현미경을 사용하여에 끼어 샘플 슬라이드를 삽입합니다. </li></ol> 양자 택일로 <ol start="10"><li> 지속적으로 또한 비디오 모드에 휴대폰 카메라를 사용하여 흐르는 세포의 형광 현미경 동영상을 캡처하는 동안, 자동 주사기 펌프를 사용하여 마이크로 유체 채널을 통해 휘황 표시 백혈구를 제공합니다. 우리는 또한 휴대용 배터리 전원 주사기 펌프 또는 중력 힘이 마이크로 유체 채널을 통해 흐름을 유도하기 위해 이용 될 수 있다는 것을 강조한다. </li></ol>

<ol>
	<li>Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry for BioTechnology. , (2005).</li><li>Nunez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow cytometry for research scientists: principle and applications. , (2001).</li><li>Mertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to optical microscopy. , (2010).</li><li>Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+deeper+than+microscopy:+the+optical+imaging+frontier+in+biology.">Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology.</a> Nature Methods. 7, 603-614 (2010).</li><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+fluorescence+nanoscopy.">Toward fluorescence nanoscopy.</a> Nature Biotechnology. 21, 1347-1355 (2003).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+structured-illumination+microscopy:+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution.">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 102, 13081-13086 (2005).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM.">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM.</a> Nature Methods. 3, 793-796 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Ma, Z., Gerton, J. M., Wade, L. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+near-field+microscopy+of+DNA+at+sub-10+nm+resolution.">Fluorescence near-field microscopy of DNA at sub-10 nm resolution.</a> Physical Review Letters. 97, 260801 (2006).</li><li>Chung, E., Kim, D., Cui, Y., Kim, Y., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+standing+wave+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy:+superresolution+imaging+of+single+molecular+and+biological+specimens.">Two-dimensional standing wave total internal reflection fluorescence microscopy: superresolution imaging of single molecular and biological specimens.</a> Biophysical Journal. 93, 1747-1757 (2007).</li><li>Greenbaum, A., Luo, W., Su, T. -. W., G&#246;r&#246;cs, Z., Xue, L., Isikman, S. O., Coskun, A. F., Mudanyali, O., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+without+lenses:+achievements+and+remaining+challenges+of+wide-field+on-chip+microscopy.">Imaging without lenses: achievements and remaining challenges of wide-field on-chip microscopy.</a> Nature Methods. 9, 889-895 (2012).</li><li>Zhu, H., Yaglidere, O., Su, T. -. W., Tseng, D., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+and+compact+wide-field+fluorescent+imaging+on+a+cell-phone.">Cost-effective and compact wide-field fluorescent imaging on a cell-phone.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 315-322 (2011).</li><li>Zhu, H., Mavandadi, S., Coskun, A. F., Yaglidere, O., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optofluidic+fluorescent+imaging+cytometry+on+a+cell+phone.">Optofluidic fluorescent imaging cytometry on a cell phone.</a> Analytical Chemistry. 83, 6641-6647 (2011).</li><li>Suzuki, S., Abe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+Visualand+Graphics.">Computer Visualand Graphics.</a> Image Processing. 30, 32-46 (1985).</li><li>Zhu, H., Sikora, U., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot+enabled+detection+of+Escherichia+coli+using+a+cell-phone.">Quantum dot enabled detection of Escherichia coli using a cell-phone.</a> Analyst. 137, 2541-2544 (2012).</li><li>Mudanyali, O., Dimitrov, S., Sikora, U., Padmanabhan, S., Navruz, I., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Rapid-Diagnostic-Test+Reader+Platform+on+a+Cellphone.">Integrated Rapid-Diagnostic-Test Reader Platform on a Cellphone.</a> Lab on a Chip. 12 (15), (2012).</li><li>Candes, E. J., Romberg, J. K., Tao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+signal+recovery+from+incomplete+and+inaccurate+measurements.">Stable signal recovery from incomplete and inaccurate measurements.</a> Communication of Pure and Applied Mathematics. 59, 1207-1223 (2006).</li></ol>

박사 Ozcan는 전산 영상과 현미경 도구를 상용화하는 것을 목표로 시동 회사의 설립자입니다.

우리는 폭 넓은 분야 형광 현미경과 휴대 전화 카메라로 경량 및 소형 광학 유체 첨부 파일을 사용하여 광학 유체 이미징 유동 세포 계측법을 기반으로 휴대 전화에 우리의 최근 결과를 발표했습니다. 이 플랫폼 기술을 사용 우리는 마이크로 입자와 전체 혈액 샘플에 표시 백혈구 등의 형광 개체를 이미지로. 따라서,이 컴팩트하고 비용 효율적인 휴대 전화 기반의 형광 이미징 도구 모음은 CD4에 ?...

현미경과 흐름 세포 계측법은 널리 생물 의학 및 과학 연구 기술 1-12뿐만 아니라 다양한 세포 유형의 계산 및 특성에 대한 임상 진단을하는 데 사용됩니다. 그러나, 기존의 현미경과 흐름 세포 계측법 장비는 주로 잘 알려진 중앙 실험실로 사용을 제한하는 상대적으로 복잡하고 비싼합니다. 최근 우리는 약속을 보여주는 휴대 전화, 13,14에 통합 된 콤팩트하고 경량 형광 이미징 세포 계측법 및 현미경 장치를 개발 비용 효율적위한 리소스 제한 환경에 형광 현미경, 흐름 세포 계측법 및 관련 마이크로 분석 기법을 번역 세계 보건에 영향을 미치는 다양한 telemedicine 응용 프로그램. optofluidic 흐름 세포 계측법 구성에서 (예를 들어 그림 1C 및 1D 참조), 맞춤 설계 polydimethysiloxane (PDMS) 기반 마이크로 유체 채널 positione입니다발광 - 다이오드 (LED)이 채널의 가장자리에 엉덩이 연결되는 휴대폰 카메라 유닛, 앞의 D. 이 마이크로 칩은 함께 액체 샘플 내부와, 여기 광이 균일 마이크로 채널 내부의 형광 라벨이 표본을 넣으려고 안내되는 등 광학 유체 평면 도파관 (예를 들어 PDMS - 액체 - PDMS 용으로 구성) 형성한다. 이 표시 객체의 형광 방출, 예를 들어 세포가 추가로 휴대폰 카메라 유닛 후에 바로 위치 추가 렌즈를 통해 이미지로되어 있으며 휴대 전화 보완 금속 - 산화물 - 반도체 (CMOS) 이미지 센서에 매핑됩니다. 형광 방출이 여기 빛의 경로에 수직 수집되어 있기 때문에, 저렴한 플라스틱 흡수 필터는 분산 된 여기 빛을 제거하기에 충분하며, 형광 이미징에 필요한 괜찮은 어두운 필드 배경을 제공 할 수 있습니다. 우리는 이미지 합계에 형광 물체도 비슷한 광학 유체 디자인을 할 수 사용형광 입자가 두 유리 사이에 끼어되는 IC 모드 (그림 1A와 1B 참조), 휴대 전화 CMOS 이미지 입자 계산을위한 센서와에 의해 캡처되어 대신 이러한 형광 입자의 마이크로 유체 채널 및 형광 방출을 통해 유동의 슬라이드 특성. 다른 응용 프로그램 요구 사항, 유동 세포 계측법이나 폭 넓은 분야 형광 현미경에 따라 선택할 수 있습니다. 예를 들어, 휴대폰 유동 세포 계측법 장치는 희귀 한 셀이나 병원균의 검출을위한 액체 샘플 (몇 ML을 예를 들어)의 큰 볼륨을 검사에 특히 유용 할 수 있습니다. 이 원고에서 우리는 컴팩트하고 비용 효율적인 광학 유체 첨부 파일을 사용하여 휴대 전화의 형광 현미경 및 이미징 유동 세포 계측법 도구의 통합에 최근 결과의 일부를 검토합니다. 이 휴대 전화 기반의 마이크로 분석, 이미징 세포 계측법 및 감지 플랫폼은 다양한 기회를 제공 할 수telemedicine과 포인트의 케어 진단, 특히 세계의 자원 제한된 지역에서 글로벌 건강 문제와의 싸움에 영향을.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number </td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-phone</td>
			<td>Sony</td>
			<td>Sony Ericsson Aino</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plano-convex lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td># NT45-302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspherical lens</td>
			<td>Thorlab</td>
			<td># C230TME-A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>#NT54-46</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>#365-1201-ND</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battery</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>#P032-ND</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#05-408-129</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysing buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7757</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red fluorescent beads (10 &mu;m)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#F8834</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent beads (10 &mu;m)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#F8836</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO16 nucleic acid fluorescent labeling</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td># S7578</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field fluorescent microscopy and fluorescent imaging flow cytometry on a cell-phone

형광 현미경과 유동 세포 계측법은 널리 생명 의학 연구 및 임상 진단에서 도구를 사용합니다. 그러나이 장치는 자원 제한 설정에서이를 덜 효율적 만들기, 일반적으로 상대적으로 부피가 큰과 비용이 많이 드는 있습니다. 잠재적으로 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 최근 소형, 경량, 그리고 비용 효율적인 광학 유체 첨부 파일을 사용하여 셀의 휴대 전화에서 폭 넓은 분야 형광 현미경 및 이미징 유동 세포 계측법 도구의 통합을 보여주고 있습니다. 우리 유동 세포 계측법 디자인에서 휘황 표시된 셀은 기존의 휴대폰 카메라 유닛 위에 위치하는 마이크로 유체 채널을 통해 플러시됩니다. 배터리 전원 발광 다이오드 (LED)가 효과적으로 여기 광이 균일 형광 목표를 자극 안내하는 멀티 모드 판 도파관, 역할이 마이크로 칩의 옆에 엉덩이 커플 링입니다. 휴대 전화 카메라를 통해 흐르는 형광 세포의 시간 경과 영화를 기록이 영화의 디지털 프레임이 관심의 대상 솔루션 내에서 레이블 셀의 개수를 계산하기 위해 처리하는 마이크로 유체 채널. 우리는이 휘황 표시 셀은 예를 들어 두개의 유리 슬라이드 사이에 형광 입자를 sandwiching하고 예를 공간적 해상도를 달성 할 수있는 휴대 전화 카메라를 사용하여 형광 이미지를 캡처하여 정적 모드에서 이미지도 비슷한 광학 유체 디자인을 할 수 있습니다 사용 ~ ~ 81mm 2의 매우 큰 뷰 필드 지난 10 μm. 이 휴대 전화는 형광 이미징 유동 세포 계측법을 기반으로하며 현미경 플랫폼은 CD4 + HIV + 환자의 모니터링을 향해 나 마시는 물에 수 인성 기생충 ​​검출을위한 T 세포의 계산 예를 들어, 특히 자원 제한 설정에 유용 할 수 있습니다.

휴대폰 카메라가 흐르는 세포의 시간 경과 형광 현미경 동영상을 기록하는 동안 펌핑 광학 유체 / 여기 체계 (인물 1C 및 1D)로 휘황 표시 세포는 지속적으로 주사기 펌프를 사용하여 마이크로 유체 채널에 제공 할 수 있습니다. 이러한 형광 영화는 이후 빠르게 형광 이미징 흐름 cytometer의 기능을 고려 자동으로 절대 번호와 마이크로 유체 채널을 통해 흐르는 세포의 밀도?...

Watch this Scientific Journal Video about Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone at JoVE.com

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

우리는 컴팩트하고 비용 효율적인 광학 유체 첨부 파일을 사용하여 휴대 전화의 형광 현미경 및 이미징 유동 세포 계측법 도구의 통합에 우리의 최근 결과를 검토합니다. 이 휴대 전화 기반 마이크로 분석 장치는 다음과 같은 자원 제한 설정에서 예를 들어, 물 시료의 높은 처리량 검사를위한뿐만 아니라 다양한 세포 계수 작업을 수행하는 등 cytometric 분석을 위해 유용 할 수 있습니다.

휴대 전화에 폭 넓은 분야 형광 현미경과 형광 이미징 유동 세포 계측법

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

wide-field-fluorescent-microscopy-fluorescent-imaging-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.5K 조회수.  University of California, Los Angeles. 우리는 컴팩트하고 비용 효율적인 광학 유체 첨부 파일을 사용하여 휴대 전화의 형광 현미경 및 이미징 유동 세포 계측법 도구의 통합에 우리의 최근 결과를 검토합니다. 이 휴대 전화 기반 마이크로 분석 장치는 다음과 같은 자원 제한 설정에서 예를 들어, 물 시료의 높은 처리량 검사를위한뿐만 아니라 다양한 세포 계수 작업을 수행하는 등 cytometric 분석을 ?...

비디오: Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

생물 학적 시스템에서 이온 농도의 측정을위한 형광 Nanoparticles

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

연구

생체공학

Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

칩에 Lensless 형광 현미경

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

나이프 - 에지 스캐닝 현미경에 대한 표본 준비, 이미징 및 분석 프로토콜

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법과 세포의 현지화 및 탄소 나노 튜브의 상대 정량

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

견인 힘 현미경의 세포 배양 표면 근처 지역화 기자 형광 구슬을위한 새로운 방법

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

다중 스펙트럼 화상 진찰 교류 세포측정을 사용하여 시험관 내 미세핵 분석기를 능력을 발휘하는 자동화된 방법

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies for the detection of CTCs include flow cytometry, microfluidic devices, and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Despite recent advances, methods for the detection of early ovarian cancer metastasis still lack the sensitivity and specificity required for clinical translation. Here, a novel method is presented for the detection of ovarian circulating tumor cells by photoacoustic flow cytometry (PAFC) utilizing a custom three dimensional (3D) printed system, including a flow chamber and syringe pump. This method utilizes folic acid-capped copper sulfide nanoparticles (FA-CuS NPs) to target SKOV-3 ovarian cancer cells by PAFC. This work demonstrates the affinity of these contrast agents for ovarian cancer cells. The results show NP characterization, PAFC detection, and NP uptake by fluorescence microscopy, thus demonstrating the potential of this novel system to detect ovarian CTCs at physiologically relevant concentrations.

A protocol is presented to detect circulating ovarian tumor cells utilizing a custom-made photoacoustic flow system and targeted folic acid-capped copper sulfide nanoparticles.

광음향 유동 세포측정을 이용한 난소암 검출

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome formulation, liposomes may be preferentially taken up by different cell types in the body. This may influence the efficacy of the therapeutic particle as progression of different diseases is tissue- and cell-type-specific. In this protocol, we present one method for synthesizing and fluorescently labeling liposomes using DSPC, cholesterol, and PEG-2000 DSPE and the lipid dye DiD as a fluorescent label. This protocol also presents an approach for delivering liposomes in vivo and assessing cell-specific uptake of liposomes using flow cytometry. This approach can be used to determine the types of cells that take up liposomes and quantify the distribution and proportion of liposome-uptake across cell types and tissues. While not mentioned in this protocol, additional assays such as immunofluorescence and single-cell fluorescence imaging on a cytometer will strengthen any findings or conclusions made as they permit assessment of intracellular staining. Protocols may also need to be adapted depending on the tissue(s) of interest.

The goal of this protocol is to synthesize fluorescently-labeled liposomes and use flow cytometry to identify in vivo localization of liposomes at a cellular level.

형광 염료 표지 리포솜의 In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake의 준비, 투여 및 평가

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...