이 절차의 전반적인 목표는 비 정황 아미노산 의 통합 및 클릭 화학을 결합하여 균일 한 글리코콘 주게이트 백신을 생산하는 것입니다. 유전 코드 확장은 부자연스러운 아미노산을 단백질에 통합하여 특성을 수정하거나, 새로운 단백질 기능을 연구하거나 만들거나, 단백질 컨쥬게이트에 접근할 수 있는 강력한 도구입니다. 코돈 억제 방법은 다른 위치에 부자연스러운 아미노산을 통합하는 가장 인기있는 방법으로 등장했다.
이러한 방법론은 생물요르토곤 기능군을 수용하는 부자연스러운 아미노산을 함유한 단백질 담체의 생산에 적용될 것이다. 이 반응성 손잡이는 다음에 균일한 글리코콘주게이트 백신을 제공하기 위해 합성 올리고당카이라이드 햅텐을 구체적으로 효율적으로 이식하는 데 사용할 수 있습니다. propargyl-lysine, PrK, 상업 Boc-lysine에서 두 단계로 합성 됩니다.
첫 번째 단계에서, Boc-lysine의 보호되지 않은 아미노 그룹은 프로파질 클로로포메이트로 변환됩니다. 두 번째 단계에서, 알파 아미노 군은 보호 해제된다. N(알파)의 합성을 위해, 먼저 5밀리그램의 Boc-lysine을 수성 한 어금니 NaOH와 5밀리리터의 플라스크에 넣고 실리콘 중격으로 플라스크에 맞춥니다.
얼음 욕조에서 플라스크를 식히고 분말이 녹을 때까지 기다립니다. 그런 다음 교반 하에서 2~3분 동안 프로파르질 클로로포메이트 드롭와이즈를 추가합니다. 반응 혼합물을 실온에서 따뜻하게 하고 10시간 동안 교반을 계속합니다.
다이틸 에테르, 수성 1개의 어금니 염산 및 에틸 아세테이트의 냉각 솔루션을 식힙니다. 얼음 욕조에서 조잡한 반응 혼합물을 식힙니다. 분리 깔때기에 혼합물을 붓습니다.
다이틸 에테르의 50 밀리리터와 혼합물을 추출합니다. 추출은 압력이 축적되어 압력 축적을 자주 방출해야 할 수 있습니다. 수성 위상을 수집하고 유기 층을 폐기하십시오.
조심스럽게, 분리 깔때기의 수성 상에 하나의 어금니 염산의 50 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음, 에틸 아세테이트의 30 밀리리터를 사용하여 수성 층을 두 번 추출한다. 유기 단계를 수집, TLC에 의해 화합물의 존재를 확인합니다.
이 단계에서는 유기 단계에 있어야합니다. 결합된 유기층을 황산마그네슘 위에 건조시다. 솔리드 위상을 필터링합니다.
그리고 회전 증발기에 대한 압력 감소하에 여과를 농축한다. 유정 N(알파)의 황량한 염화물 리신 샘플을 유정 클로로포형태로 용해하고 NMR에 의해 그 정체성을 제어한다. 프로파질-L-리신을 합성하려면 중격이 장착된 둥근 버튼 플라스크에 N(알파)의 Boc-propargyl-lysine을 소개합니다.
아곤 아래 플라스크에 아하이드루스 디클로로메탄 4밀리리터를 넣습니다. 교반 밑에 트리플루오로아세산4밀리리터를 넣으세요. TFA가 실리콘 중격을 손상시키지 않도록 유리 뚜껑에 실리콘 중격을 교체하십시오.
반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 저어줍니다. TLC에 의해 Boc-PrK의 보호 해제를 확인합니다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축합니다.
다이틸 에테르를 조잡한 잔류에 넣습니다. 프릿드 유리에 흰색 고체의 형태로 propargyl-L-lysine을 필터링합니다. 중수소 산화물에서 propargyl-L-lysine의 알리쿼트를 녹인 다음 NMR 분석을 수행하여 정체성과 순도를 제어합니다.
Propargyl-L-lysine은 100 밀리머의 최종 농도에서 증류수에 용해되고 1 밀리리터 알리쿼트에서 영하 20도에 저장됩니다. 플라스미드를 발현 변형으로 공동 변환하려면 5분 동안 화학적으로 유능한 E.Coli BL21의 100마이크로리터 알리쿼트를 얼음위에 담급드시킵니다. 각 플라스미드 또는 50~100나노그램의 마이크로리터를 세포에 넣고 얼음에 30분 동안 배양합니다.
유능한 세포를 42도에서 45초 동안 배양합니다. 그런 다음 2 분 동안 얼음에 다시 넣습니다. LB 배지의 900 마이크로리터를 추가하고 항생제 발현을 허용하기 위해 37도에서 1 시간 동안 흔들어서 배양하십시오.
그런 다음 항생제로 LB 한천에 변형 된 박테리아를 접시. 박테리아가 37도에서 하룻밤 사이에 자라도록 허용하십시오. PrK로 변형된 단백질을 표현하기 위해, 항생제를 가진 LB 배지의 5밀리리터에 단일 공동 변환된 식민지를 접종하십시오.
흔들림으로 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 항생제를 함유한 자동 유도 배지 500밀리리터, L-아라비노스0.02%, PrK 1밀리머 1개, 24시간 동안 37도에서 배양하여 희석한다. 야생형 단백질 유전자를 함유하는 클론의 배양을 수행함으로써 PrK 및 양성 대조군 없이 배양을 수행함으로써 음성 조절을 포함한다.
10 분 동안 5, 000 x g에서 원심 분리에 의해 하룻밤 배양에서 세포를 수확하십시오. 상체를 버리고 펠릿을 영하 20도에서 동결하십시오. 중력 흐름 벤치 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질의 정제를 위해 세포 펠릿을 용해 완충제의 20 밀리리터로 재보선다.
DNase I와 lysozyme를 추가하고 30 분 동안 37도에서 서스펜션을 배양하여 lysis를 허용하십시오. 5 분 동안 얼음에서 세포를 초음파 처리 한 다음 30 분 동안 20, 000 x g에서 원심 분리로 세포 파편을 제거합니다. 0.45 마이크로미터 필터로 용액을 여과하여 서스펜션에 Ni-NTA 수지 추가합니다.
1 시간 동안 4도에서 부드럽게 섞습니다. 서스펜션을 폴리프로필렌 컬럼에 붓고 언바운드 분수를 수집합니다. 수지 10밀리리터와 5밀리리터의 세척 버퍼로 씻어내라.
세척 분획을 수집합니다. 1밀리미터의 용출 완충액으로 그의 태그가 지정된 단백질을 엘테우우고 이 단계를 네 번 반복하고 모든 추가 분수를 수집합니다. 순수 히스티딘 태그 단백질을 함유한 분획을 결합하고 투석 막을 사용하여 하룻밤 사이에 TEV 프로테아제 버퍼 1리터로 투석합니다.
단백질 샘플을 50 밀리리터 튜브로 수집하고 TEV 버퍼를 추가하여 밀리리터당 최종 농도를 1밀리리터로 얻습니다. TEV 프로테아제 100마이크로리터를 추가합니다. 0.1 어금니 DTT의 마이크로리터 50기를 추가합니다.
최대 5밀리리터의 TEV 버퍼로 완성됩니다. 천천히 흔들리면서 하룻밤 동안 4도에서 배양하십시오. EDTA를 제거하려면 투석 막및 인산염 완충제가 5밀리머 이미다졸로 사용하여 하룻밤 사이에 단백질을 4도에서 투석합니다.
TEV 프로테아제와 소화되지 않은 단백질을 제거하려면 Ni-NTA 구슬과 혼합을 배양하고 4도에서 1시간 동안 부드럽게 섞습니다. 서스펜션을 폴리프로필렌 컬럼에 붓습니다. 언바운드 분수를 수집했습니다.
TEV 프로테아제와 소화되지 않은 단백질은 구슬에 묶여 있고 소화된 단백질은 용출됩니다. 5밀리리터의 세정 완충제로 컬럼을 씻고 세척 분획도 수집합니다. 소화된 단백질을 투석막으로 하룻밤 4도에서 1리터의 클릭 버퍼에 대해 투석을 하여 이미다졸을 제거하고 완충액을 교환합니다.
그리고 280 나노미터에서 단백질의 농도를 측정한다. 6헥사클로로-플루오레세인 아지드 또는 해독제 기능성 탄수화물 항원으로 MVPaA를 결합하기 위해 PrK 돌연변이 단백질을 57.8 마이크로몰라 농도의 농도로 2밀리리터 마이크로 튜브에 넣습니다. 5 밀리머 아지드 화합물의 10 마이크로 리터를 추가 한 다음 구리 황산염 용액과 THPTA의 사전 혼합을 추가합니다.
아미노구아니딘 염산염을 추가합니다. 아스코바테 나트륨의 현세적으로 준비된 수성 용액을 추가합니다. 튜브를 닫고 여러 번 반전하여 혼합하고 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.
EDTA를 추가하여 반응을 중지합니다. SDS 페이지에서 컨쥬게이션을 확인합니다. 이동 후, 플루오레세인이 있는 컨쥬게이트를 위해 312 나노미터에서 UV 광에 겔을 시각화한다.
또는 쿠마시 블루로 젤을 얼룩지게 하여 탄수화물 항원과의 컨쥬게이트를 시각화합니다. 햅텐을 첨가하면 분자량의 변화를 유도해야 한다. PBS와 함께 상형화된 젤 여과 컬럼에 적용하여 글리코콘주게이트를 정화합니다.
글리코콘주게이트를 포함하는 분획을 수집합니다. 장시간 보관을 위해 글리코콘주게이트를 증류수에 투석한 다음 동결 건조한 다음 글리코콘주게이트를 영하 80도에 보관합니다. PrK는 PsaA의 N 종자 근처 리신의 교체에 위치 32에 도입되었습니다.
MPaA 생산의 효능은 안티 히스티딘 태그 항체를 사용하여 SDS 페이지 및 서양 블롯 분석에 의해 검사되었습니다. 전체 길이 단백질의 존재는 강하게 PrK의 성공적인 통합을 나타냅니다. 강도는, 그러나, 야생 형 의원에 대 한 관찰 보다 낮은.
국회의원(K32PrK)은 니-NTA 구슬에 정제되었다. 8 밀리그램의 전형적인 수율과 PrK 잔류물의 통합으로 마침내 대량 분석법에 의해 확인되었다. 히스티딘 태그는 TEV 프로테아제를 사용하여 프로테오리틱 분열 시 제거되었습니다.
mpPsaA(K32PrK)를 갖는 알키인의 반응성은 아지도 기능성 형광제신을 이용하여 평가되었고 합성 올리고당항소를 수렴하는 데 더 사용되었다. 실험은 대조군으로 야생 형 mpaA에 비해 수행되었다. 마지막으로, 글리코콘주게이트는 젤 여과와 질량 분석법에 의해 확인된 그 정체성에 의해 정제되었다.
이 프로젝트에서, 균일한 글리코콘주게이트 백신은 정의된 부위 하에서 부자연스러운 아미노산을 통합하기 위해 호박스톱 코돈 억제 기술을 사용하여 제조되었다. 글리코콘주게이트 백신 균질성은 완전한 물리화학적 특성화를 보장하는 중요한 기준입니다. 그리고, 점점 더 까다로운 마약 기관 권고를 만족.
이 기준은 고전적인 순수 컨쥬게이션 방법을 사용하여 만족하지 않습니다. 더욱이, 이 프로토콜은 글리코콘주게이트 백신의 구조를 미세하게 조정할 수 있게 한다. 균일성과 글리코콘주게이트의 구조 사이의 관계를 연구하는 전례없는 도구를 제공합니다.
