이 방법은 사전 시냅스 말단이 생체 내에서 어떻게 작동하는지와 같은 신경 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 유용할 수 있습니다. 이 기술 세트의 주요 장점은 제노푸스 올챙이를 동물 모델로 사용하여 후각 경로의 기능을 어설프게 하는 무료 접근 법을 보여 준다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 나 자신, 베아트리체 테르니, 파올로 파치올라가 될 것입니다.
0.02%MS2 22 마취용액에 셀룰로오스 질적 필터 용지 2개를 적시고 해부 범위 아래에 배치하여 담부 절차를 시작합니다. 그런 다음 탱크에서 올챙이를 선택하고 마취 용액 접시에 담가 두세요. 올챙이는 2~4분 이내에 수영을 중단해야 합니다.
핀셋을 사용하여 꼬리 수준에 적용되는 기계적 자극에 대한 반응이 없기 때문에 적절한 마취를 확인하십시오. 마취된 올챙이를 필터 용지에 범위 아래에 놓습니다. 뇌 구조를 시각화할 수 있도록 등쪽면을 위쪽으로 향하여 동물을 배치합니다.
행동 실험의 경우 베니 가위를 사용하여 두 신경을 모두 분리하여 후각 전구에 도착하는 모든 악취 정보를 억제하십시오. 칼슘 녹색 1 개의 덱스트린 용액의 두 마이크로 리터로 폴드 유리 파이펫을적재하고 마이크로 인젝터에 넣습니다. 필터 용지에 해부 현미경 아래에 마취 된 올챙이를 놓고 파이펫 끝을 비강 캡슐의 주요 캐비티로 이동하고 염료의 0.15 내지 0.3 마이크로 리터를 전달합니다.
올챙이를 2~3분 동안 제자리에 두십시오. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 0.02%MS2 22 용액을 건조를 피하기 위해 동물의 더 많은 코들 부분에 드립하십시오. 올챙이가 10 분 이내에 정상적인 수영을 회복해야하는 복구 탱크로 동물을 옮길 수 있습니다.
주사 후 날에 후각 전구의 구체 층 의 수준에서 꽃집을 관찰하십시오. 먼저 후각 전구 위의 피부를 제거하여 이미징을 위해 마취 된 올챙이를 준비합니다. 베니 가위를 사용하여 후각 전구 의 수준에서 중추 신경계의 가장자리에 올챙이의 피부에 측면 절개를합니다.
시신경의 위치에 의해 쉽게 식별 될 수있는 텍텀으로 절단을 연장하지 마십시오. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 0.02%MS2 22 용액을 떨어 뜨린 다음 핀셋을 사용하여 절단 된 피부를 꼬집어 신경계 위로 당겨 동물을 촉촉하게 유지하십시오. 후각 전구 위에 멜라닌세포의 부재에 의해 성공적인 제거를 확인합니다.
올챙이를 셀 가드 코팅 접시의 우물에 넣습니다. 높은 진공 그리스로 코팅된 유리 커버 슬립을 배치하여 텍텀의 상단을 꼬리 끝까지 덮습니다. 후각 전구와 플라코드가 세포 외 배지에 노출되어 있는지 확인합니다.
제노푸스 링거용으로 피트리 접시를 100마이크로몰러 튜보쿠라린이 함유하여 근육 수축을 방지합니다. 올챙이를 들고 있는 접시를 직립 현미경 아래에 놓습니다. 제노푸스 링거용이 들어 있는 저수지와 폴리에틸렌 튜빙을 사용하여 제노푸스 링거 용액을 지속적으로 풍부히게 합니다.
제노푸스 링거의 솔루션을 퍼퓨처스로 시작하십시오. 실험 전반에 걸쳐 접시상수에 있는 용액의 수준을 유지한다. 혈관을 통한 혈액 순환을 관찰하여 올챙이 생존 가능성을 지속적으로 평가합니다.
올챙이를 시각화하기 위해 낮은 배율 목표를 사용하여 라이브 이미징을 시작합니다. 미세 조작기 축을 이동하여 모세관을 하나의 비강 캡슐 위에 전달하여 후각 신경으로 90도 각도를 형성합니다. 비강 캡슐에 ipsilaterally 위치한 후각 전구를 찾습니다.
장거리 작업 거리의 고배율 수분 목표로 전환합니다. I.구체 구조에 의한 꽃 방출을 확인하십시오. 먼저 신선한 아미노산 용액 20 밀리리터를 높은 저수지로 파이프로 넣습니다.
그런 다음 주택 탱크에서 6 개의 음식 박탈 된 올챙이를 가져 와서 냄새에 노출되는 것을 최소화하기 위해 깨끗한 올챙이 물 두 리터에 넣습니다. 수정된 6개의 웰 디쉬를 흰색 LED 트랜일루미노이터에 놓습니다. 올챙이 물 10밀리리터로 각 우물을 채웁니다.
올챙이 1개를 잘 놓고 적어도 3분 동안 그대로 둡니다. 이미지 수집을 시작하고 기초, 자극 및 복구 기간이 포함된 영화를 습득합니다. 매력적인 반응은 아미노산의 용액을 전달하는 노즐을 향한 움직임으로 검출될 수 있다.
이미징 후 동물을 탱크로 돌려보내보시면 됩니다. 35mm x 35밀리미터 의 영역 내의 올챙이 헤드 위치를 추적하거나 픽셀의 크기와 동등한 크기를 추적하면 후각 유도 동작을 정량적 분석할 수 있습니다. 점선은 악취 용액 입구에 대한 근접 영역을 나타낸다.
올챙이 움직임의 개별 플롯은 이미지 분석에 의해 얻은 X Y 좌표를 사용하여 구성됩니다. 추출된 운동성 플롯은 비디오 이미지를 충실하게 재현해야 합니다. 용액 입구를 중심으로 8.75 밀리미터 반경의 관심 영역은 냄새 공급원에 동물의 근접성을 분류하는 데 사용된다.
냄새의 노즐 부근에서 더 많은 시간을 보내는 것은 긍정적 인 트로피주의를 나타냅니다. 정의된 기간 동안 노즐 근처의 올챙이에 소요되는 시간(예: 15초 간격)은 아미노산 용액을 검출할 수 있는 능력을 식별할 수 있습니다. 올챙이 집단의 전체 적인 동작은 개별 데이터의 분포를 플로팅하여 얻을 수 있습니다.
아미노산 용액이 1 밀리머 또는 160 마이크로몰러에서 제조될 때 양성 열대성액을 검출할 수 있다. 동물은 물 응용 프로그램에 응답하지 않습니다. 이 절차에 따라, 조직학 기술 또는 전기 생리학과 같은 다른 방법은 부상 후 시냅스 특성의 변경과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다.
개발 후, 이 기술은 신경 생물학 분야의 연구원들이 제노푸스 올챙이의 후각 정보의 처리를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
