이 작품은 p53lab (BMSI, A * STAR)과 JCO VIP 보조금 (A * STAR)의 핵심 예산에 의해 지원되었습니다.

HEK293 세포주 프로토콜에 사용되었고 덜벡코의 수정된 이글 배지에서 10% 태아 소 혈청, 2mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신으로 보충하였다. 세포는 가습 환경에서 5% CO2로 37°C에서 배양되었다.
1. eIF4E:eIF4G604-646 보완 분석등을 통한 eIF4F 복잡한 중단에 대한 정량적 평가
<ol><li>eIF4E:eIF4G604-646 보완 분석의 세포 배양 및 일시적인 연분<ol>
<li>모든 실험에 20개 미만의 구절을 사용하여 새로 해동된 세포를 사용하십시오. 1일째에는 표준 셀 카운터를 사용하여 셀 번호를 결정하고 Trypan blue 제외방법(13)을사용하여 실행 가능한 총 셀을 계산한다.</li>
		<li>종자 6웰 플레이트0.9 - 1.2 x 106 의 HEK 293 셀의 2 mL에서 표준 성장 배지. 참고: 위에 표시된 세포주 내에서 최상의 경질 효율을 달성하기 위해 도금 된 세포가 시드 후 하루에 70-90 % 응수되도록하십시오.</li>
		<li>2일 오전, SubA-eIF4E 및 eIF4G604-646-SubB플라스미드를 이용한 공동 트랜스펙트 세포는 지질계 형 질산성 트랜스포마이트 시약(재료표참조)을 사용한다.<ol>
<li>각 배설물및 실온에서 5분 동안 배양하는 페놀 레드 없이 125 μL의 감소된 혈청 배지를 함유한 튜브에 리포솜 기반 용액의 9μL을 희석시하십시오.</li>
			<li>각 피질 튜브에 대해 125 μL의 감소된 혈청 배지에 각 플라스미드의 3 μg를 희석하여 DNA의 마스터 믹스를 준비합니다.</li>
			<li>DNA 마스터 믹스 튜브에 증강 기시약 12 μL을 추가하고 잘 섞은 다음 DNA를 즉시 추가합니다: 증강 마스터 믹스는 희석된 리포좀의 각 튜브에 1:1비율로 혼합됩니다. 실온에서 15분 동안 배양하십시오.</li>
			<li>각 우물에 DNA 지질 복합체를 추가하고 24h에 대해 5 % CO2로 37 °C 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>3일 아침, PBS 1mL로 각각 헹구는 다.</li>
		<li>PBS를 제거하고 37°C에서 5분 동안 트립신의 0.3mL로 각각 의 세포를 배양한다.</li>
		<li>각 우물에 0% FCS를 함유하는 페놀 레드 없이 감소된 혈청 배지의 2mL을 첨가하여 트립신을 중화시키고 15mL 튜브로 전염된 세포를 전달한다. 참고: 페놀 레드는 루시파아제 활동을 방해할 수 있습니다. 따라서, 세포는 페놀 레드 없이 매체에서 이 단계에서 부터 처리되어야 합니다.</li>
		<li>290 x g에서 5 분 동안 셀을 회전시키고 매체를 흡인시합니다. 0% FCS를 함유하는 페놀 레드 없이 감소된 혈청 배지의 2mL에서 세포를 다시 중단한다. 1.1 단계에서 설명된 대로 계산합니다.</li>
		<li>종자 0% FCS를 함유하지 않고 96개의 불투명 플레이트에서 90,000개의 세포밀도로 HEK 293 세포를 감염하였다. 3가지 상이한 화합물에 대해 동일한 실험 내에서 3개의 기술적 복제를 얻기 위해, 가장자리의 우물을 제외한 세포가 있는 플레이트의 60웰을 시드한다.</li>
		<li>감염된 세포를 파종한 직후 10μL의 10μL를 DMSO 화합물 용액을 추가합니다(1.2단계 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>복합 제제<ol>
<li>100% DMSO(v/v)로 관심 화합물을 용해시켜 1m 복합 스톡 솔루션을 준비한다. 각 화합물 적정에 대해 3개의 복제를 갖기 위해 1mM 복합 스톡 용액의 8μL을 사용하십시오. 참고 : 사용되는 1 mM 재고 화합물의 볼륨은 필요한 것보다 더 많은 것입니다. 이 작업은 피펫팅 오류를 고려하기 위해 수행됩니다.</li>
		<li>1m 스톡의 4μL을 각 적정점에 대해 100% DMSO의 4μL로 재고 화합물 용액의 2배 연속 희석을 수행한다. 참고: 완전한 복합 적정의 경우 시작 재고로부터 9개의 직렬 희석을 100% DMSO로 수행합니다. 여러 화합물을 테스트해야 하는 경우 이 단계와 후속 희석을 용이하게 하기 위해 96개의 웰 플레이트와 멀티채널 파이펫을 사용하십시오.</li>
		<li>2배 의 직렬 희석의 각 지점에 대해 36μL의 HPLC 급 멸균수를 추가하여 10% DMSO(v/v)에서 10배 작동 용액의 40μL을 준비합니다(즉, 100 μM ~ 0.39 μM ~ 0.39 μM 10% DMSO 스톡 시리즈는 0.039%에 10μMM의 최종 용액으로 이어질 때 0.039%의 최종 용액으로 이어질 것이다). 처리 제어는 HPLC 급 멸균 수에서 10% DMSO 전용 재고 용액을 준비합니다.</li>
		<li>10μL의 10μL을 96개의 잘 불투명한 플레이트에 추가하여 잔류 DMSO 농도가 1%(v/v)의 잔류 DMSO 농도를 100μL의 총 부피로 산출하고 5% v/v 대기 CO2로37°C에서 3시간 동안 배양한다.</li>
	</ol></li>
	<li>루시파아제 보완 및 생존 가능성 분석<ol>
<li>3h의 약물 섭취 후, 1부량의 기판과 희석 시약 19권의 희석 시약을 결합하여 루시파라기 기질 시약을 준비하기 시작한다(제조업체의 지침 참조). 참고: 루시파라제 분석은 시판되는 키트를 사용하여 수행됩니다(재료표참조).</li>
		<li>멀티채널 파이펫을 사용하여 기판 시약 25μL을 즉시 추가합니다.</li>
		<li>350 rpm에서 실온에서 궤도 셰이커에서 50 분 동안 접시를 흔들어보십시오.</li>
		<li>플레이트 판독기를 사용하여 발광을 평가합니다. 이렇게 하려면 미러 판독기를 발광 및 455에 방출 필터에 설정합니다. 측정 높이는 6.5mm로 측정 시간이 1s입니다.</li>
		<li>세포 생존가능성을 제고하기 위해 33μL의 생존가능성 분석 시약을 추가한 다음, 플레이트 판독기를 사용하여 실온에서 15분 후에 발광을 다시 측정합니다.</li>
		<li>600nm에 미러 판독기와 방출 필터를 설정하여 플레이트 판독기의 발광을 평가합니다. 측정 높이는 6.5mm로 측정 시간이 1s입니다. 참고: 생존능력은 제조업체 지침에 따라 세포 용해시에 따른 ATP의 세포내 수준을 측정하여 평가됩니다. 이 경우 생존 가능성 분석이 다른 방출 파장을 가진 다른 루시파라제를 사용하기 때문에 멀티플렉스가 가능합니다.</li>
		<li>데이터를 사용하여 데이터를 4파라미터 피팅 곡선 방정식에 맞게 곡선을 사용하여 각 화합물의 IC50 값을 결정합니다. Y = ((A-D)/(1+(x/C)^B)) + D 숫자 값 D와 A는 곡선 피팅 프로세스에서 구속되어야 합니다. eIF4E:4G 보완 분석에서 예상되는 최소한의 곡선 연삭 또는 최소한의 이론적 반응 수준에 대한 Y축의 발광 값. eIF4E:4G 보완 분석에서 예상되는 최대 곡선 연삭 또는 최대 이론적 레벨 응답에 대한 Y축의 발광 값입니다. 참고: 최소 응답에 대한 값은 1% DMSO(v/v) 대조군 처리로부터 파생되며 최대 반응의 값은 세포 생존에 영향을 미치지 않고 고원된 높은 친화성 mTOR 억제제의 최대 반응으로부터 파생된다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. eIF4E:eIF4G604-646 분석 억제와 eIF4F 복합 중단
<ol><li>분석에 의해 측정되는 신호가 화합물에 의한 eIF4E-eIF4G 상호작용의 물리적 중단에 대응하는지 확인하기 위해, 종자 세포는 1.1단계에서 설명된 바와 같이.</li>
	<li>다음날, 배지를 페놀 레드를 함유하지 않는 감소된 혈청 배지의 1mL로 교체하고 관심 있는 화합물로 4h에 대해 배양한다. 총 부피 1mL에서 잔류 DMSO 농도를 1%(v/v)로 보장합니다. 참고: 결과와의 상관관계를 쉽게 허용하기 위해 측정된 보완 분석 분석 곡의 시작점, 중간점 및 끝점에서 복합 농도를 사용한다.</li>
	<li>Lyse 세포 및 수행 m7GTP eIF4F 및 eIF4E:4EBP1 복합체를 격리 아래로 당겨. m7GTP 풀 다운 실험을 수행하는 방법에 대한 자세한 절차는 다른 곳에서 찾을 수 있습니다14.</li>
	<li>서쪽 블롯 분석에 의해 m7GTP 바운드 eIF4G, eIF4E 및 4EBP1 단백질 수준을 검출한 다음, 보완 분석 신호 억제와 eIF4F 복잡한 중단과 상관관계가 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

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본 문서에 설명된 방법은 라이브 셀에서 eIF4G-eIF4E 상호작용의 직접 측정을 통해 eIF4F 복합 조립을 정량적으로 모니터링하기 위해 루시파라제 계 보완 분석법을 활용한다. eIF4E-eIF4G 보완 시스템의 사용에 대한 세부 정보를 제공하고 있으며, 또한 eIF4E-eIF4G 상호작용16의약물 유발 4EBP1 매개 해리를 측정하는 데 시스템이 매우 정확하다는 것을 보여주었습니다. 이 분석의 처리량을 용?...

유전자 발현의 제어는 성장 증식 및 분화와 같은 세포 프로그램의 올바른 실행에 중추적 인 역할을한다. 조절 제어 메커니즘은 유전자 전사 수준 또는 mRNA 번역 수준에서 발휘될 수 있다. 지난 10 년 동안, 그것은 점점 더 분명 해지고 있다 개시 과정의 변조에 의해 번역 제어 보다는 오히려 신장 및 종료의 후반 단계 보다는 생물학적 기능의 넓은 범위를 재생 하는 단백질의 특정 하위 집합의 합성을 미세 하 게 조절할 수 있습니다.
생존에 관여하는 mRNA의 증가된 번역, 반자율적 및 반세포 반응은 여러 암에 연루되어 왔으며 또한 비정상적인 활성화 또는 번역 개시 요인1의발현에 인과 관계가 있다.
eIF4F 컴플렉스는 번역 개시의 마스터 레귤레이터입니다. mRNAs의 5'끝에 캡 구조를 결합함으로써, eIF4F는 초기 mRNA-리보솜 모집을 구동하고 차례로 약하게 번역 진핵 mRNA2의mRNA 번역 효율을 증가시키고 있다. eIF4F는 RAS/MAPK 또는 AKT/TOR 경로의 비정상적인 활성화를 수용하는 많은 암 모델에 대해 암 관련 mRNAs의 번역을 중재하여 암세포가 eIF4F를 조절하여 자체 신생물 활성을 강화하는 것을 시사합니다. eIF4F 복합형성을 억제하여 이 피드 포워드 루프의 중단은 매우 유망한 치료 전략3,4이다.
eIF4F 복합체는 (i) eIF4E, mRNA의 5' UTR에서 발견되는 캡 결합 서브유닛, (ii) eIF4A, RNA 헬리케이스 및 (iii) eIF4G, eIF4A 와 상호 작용하는 비계 단백질로 구성되며 결국40개의서브보를 모집한다. eIF4E와 eIF4G 연결은 기능성 eIF4F 복합체의 조립을 위한 속도 제한 단계이며 eIF4E 결합 단백질(4EBP, 멤버 1, 2 및 3)에 의해 부정적으로 조절된다6. 4EBP는 표준 및 비정식 eIF4E 바인딩 시퀀스7,8,9(인간 eIF4E에 대한 aa 604-646에 걸친 영역)로 구성된 인터페이스를 통해 eIF4E에 eIF4E 결합을 결합하여 eIF4E 복합 형성을 적극적으로 방지하는 eIF4E의 풀을 감소시킵니다. 이러한 단백질 단백질 상호 작용의 상호 작용은 주로 4EBP의 라파마이신 (mTOR)의 포유 동물 표적에 의해 조절된다. 미토제닉 자극시, mTOR은 4E-BP 단백질 제품군의 구성원을 직접 인광하여 eIF4E와의 연관성을 감소시키고, 이에 따라 eIF4E-eIF4G 상호 작용 및 기능성 eIF4F 복합체의 형성을 촉진한다10.
eIF4F 복잡한 무결성을 대상으로 하는 화합물 개발에 큰 노력에도 불구하고, 라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용의 직접적인 중단을 측정하는 아세약의 부족은 세포 활성 히트 화합물에 대한 검색을 제한했다. 우리는 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 통해 eIF4F 무결성의 상태를 실시간으로 모니터링하기 위해 coelenterazine 아날로그 (예를 들어, 나노 루크 기반 보완 분석)에 따라 루시파라제 분석체를 적용했습니다. 루시파아제 보완 단백질 시스템은 최소 자기 연결 및안정성(11)에최적화된 18kDa 단백질 단편(SubA)과 11개의 아미노산 펩타이드 단편(SubB)으로 구성된다. 인간 전체 길이 eIF4E 및 eIF4E 상호작용 도메인을 인간 eiF4G1(aa 604-646)으로부터 융합 제품으로 발현하면, 두 개의 상호 작용 단백질은 SubA 및 SubB 단편을 서로 가까이에 가져오고, 세포 침투성 기판의 존재가 결국 1개의 발광을 생성하게된다는활성 루시파아제의 형성을 유도할 것이다. 우리는 다른 곳에서 eIF4E:eIF4G604-646 보완 시스템16의시공 및 검증을 보고했다.
여기서는 eIF4E:eIF4G604-646 상호 보완 시스템(요청 시 사용 가능)을 사용하여 라이브 셀에서 4EBP1 매개 eIF4E-eIF4G 중단을 정확하게 측정할 수 있는 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 잠재적인 암 치료 약으로 현재 임상 시험을 받고 있는 몇몇 mTOR 억제제의 효력을 측정해서 그것의 유용성을입증합니다 12. 오프 타겟 효과는 종종 약물 관련 활동을 마스크하기 때문에, 우리는 또한 eIF4E:eIF4G604-646 시스템 측정의 다재다능성을 고려하기 위해 세포 생존성의 직교 측정으로 확장 될 수있는 방법을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

eIF4F 복합체의 형성은 종종 인간에서 온코겐성 활성화를 겪는 신호 경로의 수렴을 위한 핵심 다운스트림 노드로 나타났습니다. eIF4F는 변환 개시의 mRNA-리보솜 모집 단계에 관여하는 캡 결합 복합체이다. 암의 많은 세포 및 전임상 모델에서 eIF4F의 규제 완화는 암 증식 및 생존에 관여하는 특정 mRNA 하위 집합의 증가된 번역으로 이어집니다. eIF4F는 캡 결합 서브유닛 eIF4E, 헬리케이스 eIF4A 및 스캐폴딩 서브유닛 eIF4G로부터 제작된 이종트리메릭 복합체이다. 활성 eIF4F 복합체의 조립에 중요한 것은 eIF4E와 eIF4G 단백질 간의 단백질 단백질 상호 작용이다. 이 문서에서는 라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용 상태를 모니터링하는 eIF4F 어셈블리를 측정하는 프로토콜을 설명합니다. eIF4e:4G 세포 기반 단백질 단백질 상호 작용 분석법은 또한 eIF4F 복합 무결성의 약물 유도된 변화가 정확하고 안정적으로 평가될 수 있도록 합니다. 우리는 이 방법이 시판되는 화합물의 활성을 확인하거나 eIF4F 복합체의 형성을 효율적으로 방해하는 새로운 화합물 또는 양식의 추가 스크리닝을 위해 적용될 수 있다고 구상합니다.

eIF4E:eIF4G604-646 보편시스템의 감도를 검증하기 위해, eIF4F 복합 조립체의 4EBP1 중재 억제는 mTOR 억제제를 사용하여 평가되었다. 4EBP 단백질 제품군의 mTORC1 키나아제 의존형 인산화를 억제함으로써, mTOR 억제는 eIF4E에 4EBP1 연결을 강화하여, 따라서 eIF4F 분해15. mTOR 키나아제의 기계적으로 다른 억제제의 두 종류는 시험되었다: 라팔로그 (예를 들어, 라?...

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Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

여기서, 우리는 사용자가 선별 형식으로 eIF4F 복잡한 역학의 약물 유도 된 동요를 평가 할 수 있도록 살아있는 세포에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하는 프로토콜을 제시한다.

라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하여 eIF4F 어셈블리 모니터링

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

3.0K 조회수.  A*STAR (Agency for Science, Technology and Research). 여기서, 우리는 사용자가 선별 형식으로 eIF4F 복잡한 역학의 약물 유도 된 동요를 평가 할 수 있도록 살아있는 세포에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하는 프로토콜을 제시한다.

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Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients have achieved complete remission (CR). Approximately half of the adult patients who entered CR will relapse within 12 months due to the outgrowth of residual AML cells in the bone marrow. The quantitation of these remaining leukemia cells, known as minimal or measurable residual disease (MRD), can be a robust biomarker for the prediction of these relapses. Moreover, retrospective analysis of several studies has shown that the presence of MRD in the bone marrow of AML patients correlates with poor survival. Not only is the total leukemic population, reflected by cells harboring a leukemia associated immune-phenotype (LAIP), associated with clinical outcome, but so is the immature low frequency subpopulation of leukemia stem cells (LSC), both of which can be monitored through flow cytometry MRD or MRD-like approaches. The availability of sensitive assays that enable detection of residual leukemia (stem) cells on the basis of disease-specific or disease-associated features (abnormal molecular markers or aberrant immunophenotypes) have drastically improved MRD assessment in AML. However, given the inherent heterogeneity and complexity of AML as a disease, methods for sampling bone marrow and performing MRD and LSC analysis should be harmonized when possible. In this manuscript we describe a detailed methodology for adequate bone marrow aspirate sampling, transport, sample processing for optimal multi-color flow cytometry assessment, and gating strategies to assess MRD and LSC to aid in therapeutic decision making for AML patients.

Detection of minimal or measurable residual disease (MRD) is an important prognostic biomarker for refining risk assessment and predicting relapse in acute myeloid leukemia (AML). These comprehensive guidelines and recommendations with best practices for consistent and accurate identification and detection of MRD, may aid in making effective AML treatment decisions.

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

연구

암 연구학

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological information is also necessary. The protocol of immunocytochemical staining on paraffin-embedded cell blocks, presented herein, is an excellent alternative to immunofluorescent staining on non-paraffin-embedded fixed cells. In this protocol, a paraffin cell block from HeLa cells was prepared using the thromboplastin-plasma method, and immunocytochemistry was performed for the evaluation of two proliferation markers, CKAP2 and Ki-67. The nuclei and cytoplasmic morphology of the HeLa cells were well preserved in the cell-block slides. At the same time, the CKAP2 and Ki-67 staining patterns in the immunocytochemistry were quite similar to those in immunohistochemical staining in paraffin cancer tissues. With modified cell-culture conditions, including pre-incubation of HeLa cells under serum-free conditions, the effect could be evaluated while preserving architectural information. In conclusion, immunocytochemistry on paraffin-embedded cell blocks is an excellent alternative to immunofluorescent staining.

Currently, immunofluorescent staining on fixed cells is the method of choice for determination of protein expression levels when morphological information is also necessary. This protocol presented herein provides for an alternative method of immunocytochemistry on paraffin-embedded cell blocks.

Immunocytochemistry 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 의해 경작된 한 세포에 단백질 표정 수준 결정

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

간세포 암에서 종양-기질 상호 작용을 조사하는 3차원 스페로이드 모델

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural microenvironment and stromal cell interaction, cannot be entirely replicated with in vitro assays; thus, animal models are critical for investigating and understanding the effects of therapeutic intervention. However, most brain tumor xenografting methods do not produce brain metastases consistently in terms of the time frame and tumor burden. Brain metastasis models generated by intracardiac injection of cancer cells can result in unintended extracranial tumor burden and lead to non-brain metastatic morbidity and mortality. Although intracranial injection of cancer cells can limit extracranial tumor formation, it has several caveats, such as the injected cells frequently form a singular tumor mass at the injection site, high leptomeningeal involvement, and damage to brain vasculature during needle penetration. This protocol describes a mouse model of brain metastasis generated by internal carotid artery injection. This method produces intracranial tumors consistently without the involvement of other organs, enabling the evaluation of therapeutic agents for brain metastasis.

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Most brain metastasis mouse models are complicated by systemic metastases confounding analysis of mortality and therapeutic intervention outcomes. Presented here is a protocol for internal carotid injection of cancer cells that produces consistent intracranial tumors with minimal systemic tumors.

암세포의 내경동맥 주입에 의한 뇌전이 모델링

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex vivo drug screenings. However, current adenosine triphosphate (ATP)-based drug screening assays do not capture the complexity of a drug response (cytostatic or cytotoxic) and intratumor heterogeneity that has been shown to be retained in PDTOs due to a bulk readout. Live-cell imaging is a powerful tool to overcome this issue and visualize drug responses more in-depth. However, image analysis software is often not adapted to the three-dimensionality of PDTOs, requires fluorescent viability dyes, or is not compatible with a 384-well microplate format. This paper describes a semi-automated methodology to seed, treat, and image PDTOs in a high-throughput, 384-well format using conventional, widefield, live-cell imaging systems. In addition, we developed viability marker-free image analysis software to quantify growth rate-based drug response metrics that improve reproducibility and correct growth rate variations between different PDTO lines. Using the normalized drug response metric, which scores drug response based on the growth rate normalized to a positive and negative control condition, and a fluorescent cell death dye, cytotoxic and cytostatic drug responses can be easily distinguished, profoundly improving the classification of responders and non-responders. In addition, drug-response heterogeneity can by quantified from single-organoid drug response analysis to identify potential, resistant clones. Ultimately, this method aims to improve the prediction of clinical therapy response by capturing a multiparametric drug response signature, which includes kinetic growth arrest and cell death quantification.

This protocol describes a semi-automated method for medium- to high-throughput organoid drug screenings and microscope-agnostic, automated image analysis software to quantify and visualize multiparametric, single-organoid drug responses to capture intratumor heterogeneity.

벌크 및 단일 오가노이드 분석을 위한 광시야 라이브 셀 이미징을 사용한 다중 파라미터 종양 오가노이드 약물 스크리닝

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D tumoroids. Since patient derived tumor organoids can retain the characteristics of the original tumor, these reliable preclinical models enable cancer drug screening and the study of drug resistance mechanisms. However, CRC related death in patients is mostly associated with the presence of metastatic disease. It is therefore essential to evaluate the efficacy of anti-cancer therapies in relevant in vivo models that truly recapitulate the key molecular features of human cancer metastasis. We have established an orthotopic model based on the injection of CRC patient-derived cancer cells directly into the cecum wall of mice. These tumor cells develop primary tumors in the cecum that metastasize to the liver and lungs, which is frequently observed in patients with advanced CRC. This CRC mouse model can be used to evaluate drug responses monitored by microcomputed tomography (&#181;CT), a clinically relevant small-scale imaging method that can easily identify primary tumors or metastases in patients. Here, we describe the surgical procedure and the required methodology to implant patient-derived cancer cells in the cecum wall of immunodeficient mice.

This protocol describes the orthotopic implantation of patient-derived cancer cells in the cecum wall of immunodeficient mice. The model recapitulates advanced colorectal cancer metastatic disease and allows for the evaluation of new therapeutic drugs in a clinically relevant scenario of lung and liver metastases.

생쥐에서 환자 유래 암세포의 정형외피 이식은 진행성 대장암을 재현합니다.

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...