단백질의 정확한 정량적 측정은 질병을 생물학으로 되돌리기 위해 단백질 간의 동적 및 공간 협력을 이해하는 데 중요합니다. 이 실험의 전반적인 목적은 바이오마커 발견을 위한 라벨프리 및 라벨 기반 단백질 프로파일링을 결합하여 조직 샘플을 위한 통합 정량적 프로테오믹스 워크플로우를 제공하는 것입니다. 이 연구에서는, 우리는 라벨 기지를 둔 레이블 자유로운 접근을 사용하여 단백질을 정량화하기 위하여 악기 Orbitrap Fusion를 이용했습니다.
조직 용해는 LC-MS-MS 실험의 성공을 위한 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 구드 구타 튜브에 조직의 30 mg을 가져 가라. PBS로 세척한 후 8개의 어금니 우레아, 트리스, NaCl 및 MgCl2를 함유한 300마이크로리터의 우레아 용해 버퍼를 추가합니다.
프로브 초음파 처리기를 사용하여 조직의 내용을 lyse. 다른 주기에 대해 이 것을 반복합니다. 튜브 의 바닥에 있는 손상되지 않은 조직을 관찰하는 경우, 튜브에 지르코늄 구슬을 추가하고 얼음에 5 분 배양과 함께 90 초 동안 비드 비터를 사용하여 조직을 균질화하십시오.
원심 분리는 섭씨 4도에서 15분 동안 약 6000G의 샘플을 분리하여 셀 파편을 상체에서 분리합니다. 상체를 신선한 튜브에 모아 서용액을 균일하게 섞습니다. 브래드포드 시약을 사용하여 조직 용액의 단백질 농도를 정량화합니다.
이를 위해 595나노미터에서 샘플의 OD를 측정하고 이 화면에 표시된 표준 그래프를 사용하여 추정합니다. 단백질 정량화에 따라 12%SDS-PAGE 젤에 10 마이크로그램의 조직 용액을 실행하여 용액의 품질을 확인합니다. 용액 소화의 첫 번째 단계는 TCEP를 사용하여 이황화물 결합의 감소를 포함합니다.
TCEP의 추가에 따라, 37섭씨에서 1시간 동안 튜브의 내용을 배양한다. 다음 단계는 감소 된 이황화물 결합이 다시 형성되는 것을 방지하기 위해 용해를 포함한다. 요오도아세타미드와 같은 알킬라팅 제를 추가하고 10분 동안 어둠 속에서 튜브를 배양합니다.
인큐베이션 후, 4~8권의 희석 버퍼로 희석하여 우레아의 최종 농도를 1개 미만으로 낮춥니까. 이 시점에서 pH를 확인하는 것이 좋습니다. 다음 단계는 튜브에 트립신을 추가하고 효율적인 소화를 위해 밤새 튜브를 배양하는 것을 포함합니다.
다음 날, 소화된 펩티드를 진공 농축기에서 건조시키고 탈염 단계를 진행한다. 펩티드의 탈솔화를 수행하려면 C18 단계 팁을 사용하십시오. 메탄올 50 마이크로리터를 추가하여 C18 단계 팁을 활성화하고, 2분 동안 1000G의 원심분리기를 원심분리합니다.
이제 아세토닐릴 50마이크로리터를 0.1%의 포믹산에 추가하여 스테이지 팁을 세척하고 팁을 원심분리합니다. 말린 소화 펩티드를 0.1%의 50 마이크로리터에서 0.1%의 포믹산으로 재구성한다. 재구성된 펩티드를 활성화 된 단계 팁에 추가합니다.
이 단계를 적어도 네 번 반복합니다. 시료를 세척하려면 0.1%의 마이크로리터 를 추가하고 원심 분리 단계를 반복합니다. 펩타이드의 용출을 위해, 0.1%의 포믹산에 40%ACN의 50 마이크로리터를 추가하고 원심분리로 단계 끝을 통과한다.
0.1%의 포믹산으로 50%와 60%ACN으로 이 단계를 반복하고 신선한 튜브에서 여과물을 수집합니다. 진공 농축기로 탈염 펩티드를 건조시라. LC-MS-MS 실행 전에, 범위 방법을 사용하여 펩티드를 정량화한다.
이를 위해, 마이크로드롭 플레이트의 우물에 재구성된 시료의 2마이크로리터를 적재하고, 205나노미터 및 280나노미터에서 흡광도를 측정한다. 이 슬라이드에 설명된 수식에서 농도를 계산합니다. 탈염 펩티드가 건조되면 라벨 기반 정량화를 위한 준비가 되어 있습니다.
iTRAQ 라벨링의 경우, 건조 된 펩티드는 iTRAQ 라벨링 키트에 제공되는 용해 버퍼의 20 마이크로 리터로 재구성되어야합니다. 키트에 제공된 바이알에서 에탄올을 추가하여 라벨을 재구성하고 철저히 섞습니다. 모든 단계는 제조업체의 지침에 따라 수행되는 것이 좋습니다.
동질적으로 혼합된 iTRAQ 라벨을 각 튜브에 추가하고 라벨링 반응을 수행합니다. 반응의 끝에서, MS 급수를 추가하여 튜브에 어떤 초과 언바운드 라벨을 담금질하고, 반 시간 에서 1 시간 동안 배양. 이제 라벨이 부착된 모든 내용을 단일 튜브로 옮기고 표지된 펩티드를 건조시합니다.
샘플을 0.1%의 포믹산으로 재구성한 후 NanoLC의 자동 샘플러를 열고 자동 샘플러 내부에 샘플을 배치합니다. 샘플이 자동 샘플러에 배치되면 액체 크로마토그래피 및 질량 분광에 적합한 매개 변수를 설정하는 것이 중요합니다. 여기서는 LC-MS를 사용하여 라벨없는 수량과 iTRAQ 기반 정량화 모두에 대한 매개 변수를 설명합니다.
라벨이 없는 수량의 경우, 120분 그라데이션이 단일 분할되지 않은 샘플이 주입됨에 따라 사용되었습니다. 이 지속 시간은 샘플 복잡성에 따라 증가하거나 감소할 수 있습니다. 이 실험에서 분당 300 나노리터의 흐름은 1%포믹산에서 80%의 아세토나이트인 용액 B에 대한 다음 그라데이션으로 설정되었다.
같은 방법으로 iTRAQ 실험에 대한 그라데이션을 설정할 수 있습니다. 샘플의 분별되지 않으므로 90분 그라데이션이 사용되었습니다. 레이블이 없는 정량화와 iTRAQ 라벨 기반 정량화모두에 대한 MS 매개 변수는 여기에서 확인할 수 있습니다.
첫 번째 단계는 전역 매개 변수를 클릭하여 응용 프로그램 모드를 설정하는 것입니다. 펩티드 모드를 선택하고 사용되는 LC 그라데이션에 따라 메서드 지속 시간을 설정합니다. 실험에 대한 스캔 매개 변수를 정의합니다.
MS-OT 옵션을 클릭하면 매개 변수가 표시됩니다. 사용 중의 검출기 유형이 Orbitrap로 설정됩니다. 이 기기에서 사용할 수 있는 다른 옵션에는 이온 트랩이 포함되어 있습니다.
해상도가 60, 000으로 설정되었으며 실험의 필요성과 유형에 따라 사용할 수 있는 다양한 옵션 중에서 선택할 수 있습니다. 매스 범위는 정상이며 스캔 범위는 375에서 1700으로 설정됩니다. 다른 매개 변수는 MS 응용 프로그램의 기본값입니다.
강도 임계값이 설정되었으며 충전 상태가 2~6개 범위로 설정되었습니다. 동적 제외가 40초로 설정되었으며 질량 허용 오차는 10초로 유지됩니다. 다음 매개 변수 집합에는 MS-MS 매개 변수가 포함됩니다.
격리 모드는 쿼드러폴로 선택되었으며, 격리 창은 2개로 설정되고 격리 오프셋이 꺼져 있으며, 활성화 유형은 일반적으로 프로테오믹스 실험에 대한 HCD입니다. 충돌 에너지를 고정하거나 도움을 받을 수 있습니다. 라벨이 부착된 샘플은 더 높은 충돌 에너지를 필요로 하므로 iTRAQ 실험의 경우 충돌 에너지를 35로 설정하는 것이 바람직하며 LFQ 실험의 경우 30으로 설정할 수 있습니다.
여기서 사용되는 검출기 유형은 Orbitrap입니다. 스캔 범위 모드는 자동됩니다. 다른 매개 변수는 iTRAQ 실험 및 레이블이 없는 정량 적 실험의 기본값입니다.
요약을 클릭하면 실험에 사용되는 모든 LC 및 MS 매개 변수에 대한 개요가 표시됩니다. 당신은 각각의 모든 매개 변수에 대한 모양을 하고 교정을 할 수 있습니다. 작업이 완료되면 파일을 클릭하고 메서드 파일로 저장합니다.
저장하면 메서드를 실행할 수 있으며 원시 파일을 가져옵니다. 그런 다음 이러한 원시 파일을 Proteome 디스커버러 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있습니다. 이 수치는 세 가지 기술 복제에서 BSA의 시퀀스 커버리지를 보여 주며, 이는 세 복제에서 91%입니다.
이는 계측기의 재현성을 나타냅니다. 지금, 이 그림은 3개의 다른 생물학 견본에서 확인된 펩티드 스펙트럼 성냥, 펩티드 및 단백질의 수에 있는 균일성을 보여줍니다, 이는, 다시, 계기의 재현성에 관하여 아이디어를 줍니다. 여기서, Venn 다이어그램은 라벨이 없는 실험 및 라벨 기반 실험에서 세 가지 다른 샘플에서 확인된 일반적이고 독점적인 단백질을 나타낸다.
이러한 바 그래프는 LFQ 및 iTRAQ 실험에서 확인된 1%FDR 이후 펩티드 스펙트럼 성냥, 펩타이드 그룹, 총 단백질, 단백질 그룹 및 단백질 수의 수를 나타낸다. 생물학적 샘플의 조직 프로테오믹스는 질병 진행의 다른 단계와 관련된 새로운 잠재적인 바이오마커를 탐구할 수 있게 해줍니다. 조직 정량 적 프로테오믹 분석을 위한 기술된 프로토콜은 재현 가능한 양호한 커버리지 데이터를 제공한다.
기술 복제를 사용하면 샘플이 서로 다른 시점에서 실행되더라도 좋은 재현성을 보장합니다. 여기서, 우리는 두 가지 수량 방법을 사용하여 조직 샘플의 분석을 보여 주었다: 라벨없는 라벨 기반 프로테오믹스. 정량적 프로테오믹 기술의 선택은 시료 수, MS 플랫폼의 가용성 및 해결될 생물학적 질문에 따라 달라질 수 있습니다.
