이 방법을 통해 통합 아밀로이드 단백질 구조를 수용성 및 축적된 단백질 구조와 명확하게 구별할 수 있습니다. 이 기술은 독성 부작용이 거의 또는 전혀 없는 비침습적 방식으로 생체 내에서 수행됩니다. 형광소 자체의 형광 특성에 따라 다르기 때문에 시간이 지남에 따라 매우 견고하고 재현 할 수 있습니다.
FLIM은 암 진단 분야에서 활용되고 있습니다. 그러나, 우리는 실제로 신경 퇴행성 질병과 관련이 있는 단백질 응집의 기본적인 기계장치를 연구하기 위하여 그것을 채택합니다. 방법론은 단백질 응집 분야에서 사용될 수 있다.
관련 단백질이 형광 프로브와 태그되는 한 시간이 지남에 따라 추적 및 모니터링할 수 있습니다. 응집을 촉진하거나 방지하는 화합물 및 전략은 성공적으로 연구될 수 있습니다. 빛 현미경 검사법에 의해 시각화될 수 있는 모든 생물학적 시스템은 세포 배양, 고정 또는 투과성 시료 및 필요한 모든 매체에서 예를 들어 생체 내 또는 전 생체 내FLIM에 적합합니다.
실험 데이터를 얻기 전에 선충 내에서 선택한 불소호의 특성을 테스트하고 측정을 획득하기 전에 설정이 완벽하게 작동하는지 테스트해야 합니다. 시작하려면 NGM 플레이트에서 선충을 섭씨 20도에서 재배하고 유지하십시오. 청년 성인으로 생활의 4 일째까지 선충을 나이와 노인으로 생활의 여덟 날.
이미징 의 날에, 이미징 슬라이드를 준비하여 시작합니다. 아가로즈와 이중 증류수를 부피량으로 3%의 농도로 배치합니다. 전자레인지에 넣고 녹인 다음 약간 식힙니다.
1 밀리리터 파이펫 팁의 끝을 잘라 녹은 아가로즈의 약 200 마이크로 리터를. 파이펫은 깨끗한 유리 슬라이드에 아가로즈를 하고 즉시 거품의 형성을 피하기 위해 위에 두 번째 하나를 배치합니다. 슬라이드를 건조시키고 상단 유리 슬라이드를 부드럽게 제거합니다.
그 결과 선충이 배치될 아가로즈 표면이 있는 유리 슬라이드가 생성됩니다. 이미징 설정이 사용 준비가 되면 스테레오 현미경으로 작동하여 마취 화합물 10 마이크로 리터 드롭을 아가로즈 패드에 놓고 5 ~10 개의 선충을 부드럽게 전달하십시오. 속눈썹 팁을 사용하여 선충을 분리하십시오.
이미지 수집 중에 선충의 편산화를 쉽게 할 수 있도록 가까이 두지만 만지지 않도록 하십시오. 선충을 커버슬립으로 조심스럽게 오버레이합니다. 장착 후 1시간 이내에 측정을 수행하십시오.
선충이 완전히 움직이지 않는지 확인하십시오. FLIM 획득 소프트웨어를 엽니다. 탭 단추를 찾고 활성화 출력을 누릅니다.
스테이지에 장착된 C.elegans와 함께 슬라이드를 배치하고 10X 배율 렌즈를 전송 모드로 사용하여 슬라이드의 선충의 위치를 국소화합니다. 슬라이드를 제거하고 목표를 63X 배율 렌즈로 전환하고 필요한 침지 매체를 적용합니다. 슬라이드를 무대에 놓고 선충을 현지화합니다.
샘플 스캔을 시작합니다. 관심 영역을 선택하고 최대 투영 평면에 집중합니다. FLIM 소프트웨어의 인터페이스에서 감지된 광자 수를 미리 봅보십시오.
ADC 값은 10~4번, 10~5회 사이여야 합니다. 필요한 경우 다른 평면에 초점을 이동하거나 레이저 전력을 늘려 더 많은 광자를 수집합니다. 광자 더미를 피하면서도 충분한 양의 광자를 수집하여 수명 적합성과 측정을 해야 합니다.
메뉴 모음에서 탭을 선택하여 획득 매개 변수를 설정합니다. 단일 광자 감지를 허용하려면 스캔 동기화를 선택합니다. 수집을 고정된 시간 또는 고정된 수의 광자수로 설정합니다.
프레스 는 인수를 시작합니다. 소프트웨어를 열고 파일을 통해 FLIM 데이터 파일을 가져오고 FLIM 데이터를 로드합니다. 다른 세션과 다른 생물학적 반복에서 얻은 경우에도 하나의 조건에서 모든 샘플을로드합니다.
필요한 경우 세분화, 세분화 관리자를 통해 많은 FLIM 그림에 대한 선충을 신호하는 세그먼트. 자르기 도구가 강조 표시될 때까지 관심 영역 주위로 드래그합니다. 완료되면 확인을 누릅니다. C.elegans의 강도 기반 이미지가 나타나는 작은 영역을 선택합니다.
해당 영역의 붕괴 곡선은 인터페이스의 오른쪽에 있는 큰 부패 창에 나타납니다. 수명을 추정하기 위해 데이터 탭에서 임의로 통합된 최소 값을 40~300으로 설정하여 너무 어둡게 된 픽셀을 제외하여 적합도를 생성합니다. FLIM 신호를 이러한 값으로 제한하려면 시간 최소 및 시간 최대 수를 선택합니다.
미리 설정된 카운트 광자 하나를 변경하지 마십시오. 획득 시 활용된 레이저의 메가헤르츠에서 반복 속도를 입력합니다. 모든 포화 픽셀을 제외하려면 게이트 최대 값을 입력합니다.
수명 탭에서 사용할 전역 피팅을 선택합니다. 선택한 형광 붕괴가 다수 지수이며 단일 수명 이상을 나타낸다는 것으로 알려진 경우 기하급수 선택 수를 제외한 다른 매개 변수를 변경하지 마십시오. IRF 메뉴를 통해 IRF를 업로드합니다.
IRF 시프트를 추정하려면 IRF를 선택하고 IRF 시프트를 추정합니다. 값 집합이 IRF 탭에 자동으로 나타납니다. 이 설정이 설정되면 이 탭의 다른 매개 변수는 변경하지 않습니다.
모든 매개 변수가 설정되면 맞춤 데이터 집합을 누릅니다. 파란색 선에서 강조 표시된 결과 맞춤은 모든 이벤트와 겹쳐야 합니다. 모든 이벤트가 핏에 따라 정렬될 때 좋은 착용감을 얻을 수 있습니다.
소프트웨어 인터페이스의 오른쪽 상단 메뉴 내에 있는 매개 변수 탭을 클릭하고 통계, 가중 평균을 선택하고 치 사각형 값이 가능한 한 하나에 가깝게 있는지 확인합니다. 따라서 선택한 이미지의 수명 값이 타우 하나로 드러난다. 파일, 내보내기 강도 이미지, 적합 결과 테이블, 이미지, 히스토그램을 통해 관심있는 정보를 내보냅니다.
4일째 또는 8일째에 근력 Q40 RFP를 표현하는 C.elegans의 대표적인 지도가 여기에 표시됩니다. IQ85의 더 긴 Q 스트레칭은 집계하는 경향이 있었고 이미 4 일째에 히스토그램의 형광 평생 변화를 보였습니다. 사실, 4 일째에 IQ85에 대한 포시 형성이 관찰되었지만 IQ44에는 여전히 존재하지 않았습니다.
그러나 노화시 IQ44는 포시 형성을 나타내므로 형광 수명이 감소했습니다. 마지막으로, 포시 형성은 NQ40CFP 균주에서 형광 수명을 감소시키지 도 하였다. 이 긴장을 위해, 노화 시 평균 형광 수명에 만 미묘한 비 유의한 변화가 있었다.
선충 모델이 확립되면 수집된 광자의 양이 가장 적합합니다. 이 방법은 포토표백, FRAP 또는 측정 후 포스터 공명 에너지 전달, FRET, 형광 회수와 같은 다른 기술과 더욱 결합될 수 있다. 이러한 모든 적응은 단백질 연구의 특성과 집계된 형태에 대한 추가 정보를 제공합니다.
단백질 응집 및 단백질 항상성의 분야에서, 기술은 시스템에 부과된 어떤 동요든지, 다른 단백질 종의 분포 및 인신 매매 및 일반적으로 살아있는 유기체 내의 수용성 및 불용성 단백질 분획의 차이 그리고 중요성을 조사할 수 있었습니다. 마취 나트륨 아지드는 독성이 있으며 장갑과 고글로 취급하고 연기 후드 아래에 희석해야합니다. 이 기술은 현미경 기지를 기반으로 하기 때문에 레이저와 관련된 모든 경고를 따르는 것이 중요합니다.
