단백질 응집의 메카니즘은 지금까지 대부분 시험관내에서 조사되었다. 우리의 프로토콜을 통해 우리는 모델 유기체 C.elegans에서 유사한 양적 연구를 수행 할 수 있습니다. 우리 방법의 가장 큰 장점은 포함 숫자의 편향되지 않은 정량화입니다.
그리고 이러한 고품질 데이터를 수학적 모델에 적용함으로써 집계 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 단백질 응집은 알츠하이머 병과 헌팅턴을 포함한 많은 질병에서 발생합니다. 생체 내에서 단백질 응집의 분자 메커니즘을 이해하는 것은 새로운 치료법을 개발하는 데 중요합니다.
먼저 10 마리의 성인 선충류를 6cm 씨드 NGM 플레이트에 배치하고 백금 웜 픽을 사용하여 동기화 된 알을 낳습니다. 접시에서 제거하기 전에 성인에게 20 C에서 약 2 시간 동안 알을 낳도록하십시오. 알이있는 접시를 20 C의 인큐베이터에 넣으십시오.알을 낳은 후 약 사흘째에 성인이 될 때까지 동물의 발달을 모니터링하십시오.
마취제로서 25 mM 소듐 아지드로 보충된 100 L의 M9 완충액으로 필요한 수의 웰을 채워서 384-웰 플레이트를 준비한다. 이미징 할 변형 당 하나의 웰을 채 웁니다. 각 균주에 대해 백금 웜 픽을 사용하여 20 마리의 동물을 하나의 우물로 옮깁니다.
플레이트를 뚜껑으로 덮어 증발을 방지하고 준비 후 한 시간 이내에 플레이트를 이미지화하십시오. 계측기를 켜고 소프트웨어를 엽니다. 웰 플레이트 언로드 옆의 재생 버튼을 클릭하고 현미경에 384웰 플레이트를 놓습니다.
작업 목록 및 3D 형광 획득에서 테스트를 클릭하고 웜이 포함된 웰을 선택합니다. 이미지 처리를 없음으로 설정합니다. 그리고 재생 버튼을 클릭하여 웜이 올바르게 중앙에 위치하는 최적의 변속 거리를 결정합니다.
오름차순 거리를 50m로, 내림차순 거리를 50m로, 슬라이싱 간격을 2m로 설정하여 z-스택에 있는 동물의 전체 두께를 캡처합니다. 이미지 처리를 다시 최대로 설정합니다. 웰 플레이트 스캔 설정에서 이미지화할 웰을 선택합니다.
그런 다음 타일을 선택하고 전체 우물을 획득하십시오. 측정 설정을 저장합니다. 그리고 측정 시작을 클릭하여 실험을 시작합니다.
CellProfiler를 열고 파이프라인을 여기에 파이프라인 파일 놓기 창으로 끕니다. 예를 클릭하여 프로젝트를 로드합니다. 그런 다음 스티치 된 이미지를 파일 및 폴더 놓기 창으로 드래그하십시오.
메타데이터 입력 모듈을 클릭합니다. 정규식을 조정하여 스티치된 이미지의 이름에 따라 파일 이름에서 추출합니다. NamesAndTypes 입력 모듈을 클릭하고 파일 이름의 채널과 일치하도록 규칙 조건 선택을 조정합니다.
그런 다음 출력 설정을 클릭하여 CellProfiler에서 출력을 저장할 폴더를 선택하십시오. 테스트 모드 시작을 클릭하여 첫 번째 이미징 데이터 세트를 사용하여 파이프라인의 설정을 확인합니다. Step 을 클릭하여 한 번에 하나의 모듈 인 파이프 라인을 통해 실행하십시오.
웜 윤곽선을 조정하려면 EditObjectsManually 모듈에서 도움말 표시를 클릭하여 지침을 확인합니다. 윤곽선을 수정합니다. 그런 다음 완료를 클릭하여 파이프 라인을 계속 실행하십시오.
테스트 모드 종료를 클릭하고 이미지 분석을 클릭하십시오. 출력 폴더를 열어 출력 파일을 봅니다. 원본 파일 이름 다음에 윤곽선이있는 이미지를 열어 웜과 포함물이 올바르게 겹쳐져 있는지 확인하십시오.
AmyloFit 사용을 시작하려면 프로젝트 이름을 지정하고 프로젝트 만들기를 클릭합니다. 열기를 클릭하여 엽니다. 그리고 이름을 지정하고 세션 만들기 및로드를 클릭하여 세션을 만듭니다.
데이터 추가를 클릭하고 왼쪽 패널에 표시된 데이터 형식 요구 사항에 따라 동물당 평균 포함 수를 포함하는 파일을 업로드합니다. 그런 다음 새 데이터로드를 클릭하십시오. 0점 오프셋에 대해 점 수를 평균으로 설정하고, 고원의 평균 이상인 점 수를 0으로 설정하여 포함 카운트 데이터에 필요하지 않은 전처리 단계를 건너뜁니다.
그런 다음 제출을 클릭하십시오. 각 단백질 농도에 대해이 단계를 반복하십시오. 모델 패널에서 사용자 지정을 선택합니다.
수식 상자에 독립 핵화에 대한 방정식을 입력합니다. 그리고 모델 로드를 클릭합니다. Ncells의 경우 매개 변수 유형을 전역 상수로 설정하고 체벽 근육 세포 수에 해당하는 값을 95로 설정합니다.
매개 변수 유형을 Kcell 및 n에 대해 전역 맞춤으로 설정합니다. 그리고 m에 대한 상수. 왼쪽 패널에 다른 변형선에 대한 m 값을 입력합니다.
분지 홉 수를 변경하지 않고 [피팅] 패널에서 [맞춤]을 클릭합니다. 마지막으로 데이터 다운로드 및 맞춤을 클릭하여 맞춤을 추출합니다. 포함 숫자는 상이한 Q40 농도를 발현하는 4개의 C.elegans 균주에서 모니터링되었다.
독립적인 핵형성 모델은 응집 동역학을 잘 기술한다. 적합도는 2.1의 반응 순서를 산출하고, 1 mM의 세포내 단백질 농도에서 세포당 1일 0.38 분자의 핵생성 속도를 산출하였다. 이전 연구에서 두 개의 독립적인 생물학적 반복실험은 반응 순서 및 핵 생성 속도에 대해 밀접하게 상응하는 값을 보였다.
명심해야 할 한 가지는 신뢰할 수있는 적합성을 얻기 위해 여러 단백질 농도에 대한 고품질 데이터 세트가 필요하다는 것입니다. 이 방법은 유전자 녹다운 또는 소분자 치료와 같은 살아있는 유기체에서 단백질 응집을 방해하는 방법을 찾는 데 사용할 수 있습니다.
