우리는 여기에 원시 현미경 이미지에서 관심의 곧게 된 웜의 단일 또는 다중 채널 몽타주를 생성하는 데 사용할 수있는 웜 정렬이라는 간단한 오픈 소스 피지 기반워크를 설명합니다. 이 워크플로는 사용자가 선택한 관심 있는 동물에 의존하므로 웜이 올바른 단계 또는 상태가 아닌 C.elegans의 이미지를 분석할 때 특히 유용할 수 있습니다. 웜 정렬의 출력피지 또는 다른 이미지 분석 소프트웨어와 형광의 후속 정량화에 사용할 수 있다는 점에 유의해야 한다.
여기서 우리는 CellProfiler 파이프라인 Worm_CP 사용하여 형광 정량화를 보여줍니다. 화염에 연장 후, 확장 후 두 조각으로 부서지지 않으면 모세관을 두 조각으로 부수습니다.
두 조각으로 부서진 경우 가장 긴 것의 끝을 잘라냅니다. 더 긴 조각을 선택하고 모세관이 물을 흡인하려고 시도하여 열려 있는지 여부를 테스트합니다. 3mm 실리콘 튜브에서 어댑터를 분리합니다.
유리 모세관을 6mm 실리콘 튜브에 연결된 모세관 어댑터에 연결합니다. 그런 다음 6mm 튜브의 다른 쪽 끝을 0.2 마이크로미터 필터와 다른 쪽 끝에 3밀리미터 실리콘 튜브에 연결합니다. 1밀리미터 필터 팁을 3mm 실리콘 튜브의 프리 엔드에 연결하여 액체를 흡인합니다.
해부 현미경에서, 입 마이크로 피펫고정 된 벌레의 펠릿 주위에 가능한 한 많은 액체를 제거합니다. 튜브 바닥에 10 마이크로리터의 장착 매체를 빠르게 추가합니다. PBS에 10 마이크로리터 팁을 헹구고 세제 의 흔적으로 벌레가 플라스틱 파이펫 팁의 측면에 달라붙는 것을 방지합니다.
그런 다음 팁의 맨 끝을 가위로 잘라냅니다. 이전에 준비된 아가로즈 패드에 웜을 장착한 8개의 마이크로리터를 이송합니다. 현미경 아래 슬라이드를 관찰하는 동안 웜의 겹치지 않도록 부드럽게 동요하십시오.
그런 다음 아가로즈 패드에 장착 매체의 드롭을 18 18 mm 커버 슬립으로 덮습니다. 살아있는 벌레를 장착하기 위해 M9에 용해된 3밀리머 레바미솔의 3~4마이크로리터를 아가로즈 패드에 실어 주어 있다. 레바미솔을 떨어뜨리기 위해 조건당 30~50개의 웜을 선택합니다.
그런 다음 18 18mm 커버슬립으로 드롭을 덮고 1시간 이내에 웜을 이미지화합니다. ImageJ에서 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어 패키지 피지를 설치, 또는 이미 컴퓨터에 설치 되어 있는 경우, 버전 1.52A 이상 인지 확인, 다음 GitHub에서 웜 정렬 저장소를 다운로드 하 고 컴퓨터에 저장. 모든 파이프라인 구성 요소를 다운로드하여 설치하면 피지를 열고 플러그인, 매크로를 클릭하여 웜 정렬 매크로를 실행하고 메인 메뉴 표시줄에서 실행합니다.
웜 정렬을 찾습니다. ijm 스크립트를 클릭하고 엽니 다. 분석할 이미지가 있는 입력 폴더로 이동하여 선택한 폴더에 이미지 파일만 포함되어 있는지 확인합니다.
매크로는 모든 결과가 저장되는 출력 폴더를 자동으로 생성합니다. 폴더의 이름은 포스트 픽스로 출력된 입력 폴더와 동일합니다. 매크로가 입력 폴더에서 첫 번째 이미지를 열고 이를 대표 이미지로 사용하여 웜의 너비, 밝기 및 대비를 포함하여 몽타주를 생성하는 데 필요한 설정을 추출하도록 허용합니다.
직선 그리기 도구를 사용하여 웜 너비에 선을 그리고 확인을 클릭합니다. 이 선의 길이를 사용하여 단일 웜에 대한 자른 영역의 높이를 결정합니다. 각 채널에 대해 이름, 조회 테이블 및 몽타주에 포함해야 하는지 여부를 지정한 다음 확인을 클릭합니다. 다음으로 슬라이더를 사용하여 채널의 밝기 및 대비 설정을 조정합니다. 나머지 채널에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
모든 설정이 구성되면 설정 테이블에 기록되어 출력 폴더의 CellProfiler 하위 폴더에 저장됩니다. 설정 응용 프로그램 후 모든 이미지가 어떻게 보일지 보여 줄 이미지를 생성합니다. 이미지가 만족스럽으면 상단 상자를 체크합니다.
모든 설정 패널의 두 번째 및 세 번째 상자는 몽타주 생성에 대한 옵션을 지정합니다. 두 상자를 체크하고 확인을 클릭하여 매크로의 나머지 부분을 실행합니다. 상단 상자를 선택하지 않으면 매크로가 설정을 다시 실행합니다.
그런 다음 매크로가 입력 폴더의 모든 이미지를 엽니다. 각 이미지에 대해 분할 된 또는 프리 핸드 라인 도구를 사용하여 몽타주에 포함 될 모든 웜의 세로 축에 선을 그립니다. 웜의 전체 길이를 따라 머리에서 꼬리 또는 그 반대의 경우도 마찬가지인 라인을 일관되게 그리고 원하는 모든 웜이 추가되면 컨트롤 T.를 클릭하여 각 줄을 ROI 관리자에 추가하면 확인을 클릭합니다. 그런 다음 웜 정렬은 선택한 단일 웜의 자른 이미지를 생성하며, 이는 출력 폴더의 단일 웜 하위 폴더에 저장됩니다.
선택한 모든 웜의 몽타주가 정렬된 폴더에 저장됩니다. 다운로드 및 다운로드 페이지에서 이전 CellProfiler 릴리스에 대한 링크를 클릭하고 필요한 운영 체제를 선택하여 CellProfiler 2.2.0을 다운로드하고 설치합니다. Worm_CP 파이프라인을 시작하기 전에 예상되는 모든 출력 이미지가 웜 정렬 출력 폴더의 CellProfiler 하위 폴더에 있는지 확인합니다.
원본 이미지의 처리된 복사본, 웜 채우기의 이진 이미지 마스크, 선택한 웜에 선이 그려지는 경우 마스크를 정렬하고 원본 이미지의 각 채널을 나타내는 하나의 이미지가 있어야 합니다. CellProfiler를 열고 이미지 입력 모듈을 클릭하고 여기에서 파일 및 폴더를 놓는 다고 적는 셀 프로파일러 모듈 폴더를 창으로 드래그합니다. 이전 분석에서 이미지 목록이 있는 경우 먼저 창을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 명확한 파일 목록을 선택하여 이미지 목록을 제거합니다.
메타데이터 입력 모듈을 클릭하고 두 번째 추출 방법을 클릭하고 노란색 폴더를 클릭하고 웜 정렬 출력 폴더의 CellProfiler 하위 폴더로 이동합니다. 설정 파일을 선택한 다음 업데이트를 클릭합니다. 그런 다음 이름 및 유형 입력 모듈을 클릭하고 파이프라인에 필요한 모든 이미지가 있는지 확인합니다.
파이프라인을 실행하기 전에 출력 결과에 대한 대상을 선택합니다. 테스트 모드를 사용하여 시작 테스트 모드를 클릭하여 파이프라인의 성능을 확인하고 폴더의 첫 번째 이미지를 통해 실행할 수 있습니다. 파이프라인의 성능에 만족하면 종료 테스트 모드를 클릭하고 이미지를 분석합니다.
분석을 시작하기 전에 분석 모듈 앞의 모든 눈이 닫혀 있는지 확인합니다. 분석이 완료되면 두 개의 CSV 파일, 웜 CSV 및 라인 CSV로 구성된 Worm_CP 출력 폴더를 엽니다. 이 프로토콜에 설명된 방법에 따라 C.elegans를 배양하고 이미징하면 웜 개체수의 큰 개요 이미지가 생성됩니다.
파이프라인의 출력은 주로 이미지 위에 그려진 선의 품질에 따라 달라집니다. 웜 정렬의 여러 줄 예제와 출력이 여기에 표시됩니다. 웜 정렬 스크립트를 사용하는 경우 데이터 하위 폴더에 있는 오버레이 이미지와 몽타주에 있는 개별 웜 패널에서 교차하는 웜의 시각적 식별이 가능합니다.
QC 테이블을 사용하여 겹치는 웜을 식별할 수도 있습니다. 그러나 교차하는 선은 Worm_CP 파이프라인에 문제가 있습니다. 이는 Worm_CP 관심 영역이 아닌 라인 마스크를 사용하여 개별 웜을 식별하는 데 도움이 되기 때문입니다.
따라서 CellProfiler는 웜 중 하나를 두 개체로 분할합니다. Worm_CP 파이프라인은 지질 방울에 통합되는 형광염으로 표시된 고정 동물의 형광 강도를 정량화하는 데 사용되었습니다. 지질 물방울 함량은 수동 정량화를 사용하여 야생 유형과 돌연변이 DBL1 동물 사이에 17 % 감소하고, Worm_CP 파이프 라인을 사용하여 12 % 감소합니다.
Worm_CP 또한 열 충격 유도 유전자의 통제하에 GFP를 표현하는 살아있는 벌레에서 열 충격 반응을 정량화하기 위하여 이용되었습니다. 열 응력의 부재에서, 벌레는 GFP 발현을 유도하지 않았다. 웜이 짧은 열 충격으로 노출되면 GFP 발현이 유도됩니다.
Worm_CP 출력은 주로 웜 정렬을 사용하여 그리는 선의 품질에 따라 달라집니다. 선이 닿거나 겹치지 않고 모든 선을 같은 방향으로 그립니다. QC 테이블을 확인하면 분석에서 이러한 사례를 제외할 수 있도록 만지거나 겹치는 줄을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
웜 정렬의 출력은 피지 또는 다른 이미지 분석 소프트웨어 패키지에서 후속 정량화에 사용할 수 있습니다. 우리는 여기에 다른 분석 모듈이 매우 쉽게 통합 될 수있는 매우 기본적인 CellProfiler 파이프 라인을 보여 주었다, 예를 들어, 지질 방울의 수를 계산하거나 웜 내에서 개별 방울의 강도를 정량화. 이 기술의 장점 중 하나는 개별 벌레에서 형광을 신속하게 정량화 할 수있는 가능성입니다.
우리의 실험실에서, 우리는 형광 기자를 사용하여 개별 생존가능성에 관심이 있고 우리는 이 목적을 위해 웜 정렬 및 Worm_CP 일상적으로 사용합니다.
