저자는 닐루 사라 아덴과 중조가 이 원고에 대한 건설적인 검토를 인정하기를 원합니다. 저자는 또한이 프로젝트 동안 필수적인 입력린지 브라운감사하고 싶습니다. 이 작업에 대한 부분적인 내부 자금 및 지원은 CDER 크리티컬 경로 프로그램 (CA #1-13)과 CDER 제조 과학, 우수 프로그램의 혁신 센터 (Berilla-CoE-19-49)에 의해 제공되었습니다. 이 프로젝트는 미국 에너지 및 FDA 부서 간의 기관 간 계약을 통해 오크 리지 과학 교육 연구소가 관리하는 미국 식품 의약국의 인턴십 /연구 참여 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
이 출판물은 저자의 견해를 반영하며 FDA의 견해 또는 정책을 나타내는 것으로 해석되어서는 안됩니다.

1. AWS 준비
참고: 이 프로토콜은 하나의 축전 챔버를 사용하여 개발되었습니다. 그러나 벤치 스케일 AWS에는 필요한 경우 4개의 식도 챔버를 연속으로 작동할 수 있는 5개의 탁도 프로브가 있습니다.
<ol><li>탁도 케이블을 F, 1, 2, 3, 4(예: 도 2a의 도 1c 및 포트 1의 탁도 프로브 1) 및 챔버 전원 BNC 케이블을 1, 2, 3, 4(그림2b)로표시된 AWS 시스템의 뒷면에 연결합니다. 참고: 챔버 전원 BNC케이블(도 3c)의다른 쪽 끝을 아쿠스토포레틱 챔버(도3d)의뒷면에 챔버가 유체로 채워질 때 2.6단계까지 연결하지 마십시오. 챔버 전원이 챔버에 유체없이 켜져 있으면 챔버의 압압 트랜스듀서가 손상되고 더 이상 작동하지 않습니다.</li>
	<li>탁도 프로브를 탁도 미터 및 온도계 하우징에 삽입하고 나사를 조입니다(도1c 및 도 3).</li>
	<li>피드 튜빙을 피드 펌프(도 1b ~1c)를통해 사료탁도 포트(도4a)의입력에 연결합니다.</li>
	<li>사료 탁도포트(도 4b)의출력에서 y-튜브를 축전챔버(도 4c)의입구 포트에 연결한다.</li>
	<li>단계1 펌프를 통해 수선체(도4d)의폐포트에서 1단계 튜브를 세포 수거용기(도1d~1f)에연결한다.</li>
	<li>유상증실(도4e)의침투포트로부터 튜브를 프로브1 탁도 포트(도4f)의입력에 연결한다.</li>
	<li>프로브1 탁도포트(도 4g)에서상품 수집 용기(도1c ~ 1g)에수확 튜브를 연결합니다.</li>
</ol>2. HCCF로 시스템을 프라임
참고: 본 프로토콜은 화학적으로 정의된 배지(액티초 P+6m L-글루타민)를 사용하여 개발되었으며, 모델 IgG1 단클론 항체 VRC0113을 생산하고 다른 세포주 및 제품에 맞게 조정해야 할 수도 있다. 이 프로토콜에 사용된 HCCF는 흔들리는 플라스크 또는 생물 반응기 공정에서 CHO-K1 배양의 7-8 일 말에 얻어졌다.
<ol><li>AWS의 뒷면과 전면에 있는 전원 스위치를 켜서 AWS를 켭니다.</li>
	<li>컴퓨터를 켜고 관련 소프트웨어의 책상 아이콘을 두 번 클릭합니다(재료 표참조). "판독"패널에서"시작 테스트"버튼을 눌러 데이터 기록을 시작합니다(그림5). 데이터 기록이 시작되면 수집된 모든 데이터가 테스트가 중지될 때까지 내보낼 수 있는 스프레드시트에 기록됩니다.</li>
	<li>이송 튜브 끝을 교반되는 HCCF 용기에 연결합니다.</li>
	<li>"피드펌프 이미지"내의"컨트롤"화면의 펌프 속도를 입력하여 피드 펌프를 시작하고 키보드에서"Enter"를 누릅니다. "펌프방향 화살표 아이콘"(시계 방향 또는 시계 반대 방향)가 용기에서 혈관에서 수선 챔버로 HCCF를 펌핑하기 위해 피드 펌프 이미지의 오른쪽에 있는 회색 상자에 올바르게 선택되었는지 확인합니다. "시작"펌프(그림 6a)에피드 펌프 이미지 아래 회색 상자 내에서"켜기"라는단어 옆에있는"삼각형 아이콘"을클릭합니다. 참고: 최대 펌프 속도는 10 L/h(167mL/min)이지만, 명목 유량인 60mL/min은 분리를 시작하기 전에 챔버를 과충할 위험이 없이 빠르게 튜브및 챔버를 채우기 위해 이 단계에 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>수선식 챔버를 채우는 동안"백분율 감소패널"(도5c)을관찰하여 공급 탁도 측정을 모니터링합니다. HCCF가 HCCF 용기에서 충분히 혼합되는 경우 챔버의 적재 중에 탁도 값은 일관되게 유지됩니다.</li>
	<li>액체가 유상증식 챔버 뒤쪽의 압착기 위에 있으면 피드 펌프 이미지 아래의 회색 상자 내에서"끄기"를눌러 펌프를 중지합니다. BNC 전원케이블(도 3c)을축전 챔버(도3d)에 연결합니다. 참고: 각 축축수 챔버의 홀드업 부피는 약 190mL입니다.</li>
</ol>3. AWS 운영
<ol><li>식수절 챔버가 채워지고 BNC 전원 케이블이 구균식 챔버의 뒷면에 연결되면 피드 펌프의 속도를 원하는 작동속도(도6a 및 표 1)로변경합니다. 지정된 프로세스에 이상적인 작동 파라미터를 식별하기 위해 여러 피드 펌프 속도를 테스트해야 합니다.</li>
	<li>파워 모듈의 막대를 10W(도6d)로슬라이딩하고 스테이지 1 박스(그림6c)의오른쪽에 있는"켜기"아이콘을 눌러 스테이지1 압조 파워를 켭니다. 제조업체에서 제안한 대로 CHO 셀에 권장되는 전원 설정인 10W를 사용하십시오. 이렇게 하면 작동을 위해 2MHz의 고정 주파수가 생성됩니다. 몇 초 후, 세포는 수선화 챔버(도 7a)에서파도 노드에서 눈에 띄게 덩어리가 시작됩니다.</li>
	<li>세포가 축축챔버(도7b)의바닥에 정착하기 시작하면, 세포 밀도 및 공급 펌프 속도에 따라 적절한 속도로 stage1 펌프를시작합니다(도 6b). 제조업체의 최적화 및 정상 상태 작동 스프레드시트에 기초하여, stage1 펌프 속도는 다음 방정식을 사용하여 포장된 셀 질량 및 공급 유량에 따라 계산될 수 있습니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ01.jpg"><ol>
<li>포장 된 셀 질량을 계산하려면 빈 15 mL 튜브 (또는 원심 분리와 호환되는 다른 튜브)로 스케일을 타십시오. 튜브를 피드 재료로 채우고 튜브의 총 중량을 피드로 기록합니다. 3,700 x g에서10 분 동안 튜브원심분리하십시오. 상체를 별도의 용기에 넣습니다. 세포 펠릿으로 튜브의 무게를 측정합니다. 사료 재료의 포장 된 세포 질량 비율 = (탈캔화 튜브 무게 / 채워진 튜브 무게) x 100 %.</li>
	</ol>
</li>
	<li>혼수상 챔버로부터의 오버플로가 탁도 프로브1(도8)에진입함에 따라 스테이지1 탁도의 탁도 프로파일을 모니터링한다.</li>
	<li>세포 분리가 계속됨에 따라 세포 제거 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg"> 효율이 증가합니다.</li>
	<li>또한, 세포 분리가 계속됨에 따라 사료와 스테이지1 간의 온도 차이를 모니터링한다(도9). 높은 세포 밀도 공급이 사용될 때 온도가 상승할 수 있지만 일반적으로 공급 유량을 변경하여 감소될 수 있다. 참고: 여러 개의 혼수식 챔버를 사용하는 경우, 탁도 프로브를 통해 이전 식수전성 챔버에서 튜브를 현재 의 혼수식 챔버의 입력에 순차적으로 연결할 수 있습니다. 또한, 단계 펌프를 통해 수선식 챔버의 바닥에서 부터 세포 수집 용기에 스테이지 튜브를 연결할 수 있다. 필요한 경우 최적의 세포 제거 효율을 위해 총 4개의 식수성 챔버를 연이어 연결할 수 있습니다.</li>
</ol>4. AWS 종료
<ol><li>런이 끝나면 피드 펌프 아래의 회색 상자 내에서 끄기와 stage1 펌프 이미지를 각각 눌러 펌프를 중지하여 펌프를 중지합니다.</li>
	<li>스테이지 1 박스의 오른쪽에 전원을 끄고 BNC 전원 케이블을 분리하여 챔버에 전원을 끕니다.</li>
	<li>깊이 여과 및 크로마토그래피 방법과 같은 추가 설명 및 정화 절차를 위해 수집 된 제품 수확 재료를 가져 가라. 셀 수확 재료를 폐기하십시오.</li>
	<li>폐튜브를 빈 용기에 넣고, 관도를 분리하고 포트에 침투하고 펌프 헤드에서 폐튜브를 방출하여 유수방의 나머지 유체를 배출합니다.</li>
	<li>튜브를 다시 연결하고, 폐튜브를 펌프 헤드에 다시 넣고, 60mL/min의 급식 펌프 속도와 60mL/분의 스테이지1 펌프 속도를 사용하여 사료 튜브 의 끝에서 DI 물을 통해 흐르고 있습니다. 15-20분 동안 계속하십시오. 흐름을 폐기합니다.</li>
	<li>15-20 분 동안 피드 펌프를 사용하여 튜브 및 챔버를 통해 70 % 이소 프로필 알코올 (IPA)을 펌프합니다. 흐름을 폐기합니다.</li>
	<li>15-20 분 동안 피드 펌프를 사용하여 튜브와 챔버를 지우기 위해 DI 물로 세척 절차를 반복하십시오. 흐름을 폐기합니다.</li>
	<li>탁도 프로브와 구균 챔버에서 튜브를 분해하고 70 %의 IPA로 영역을 청소하십시오.</li>
	<li>탁도 프로브를 분해하고 70%의 IPA로 탁도 프로브 내부를 청소합니다. 모든 부품을 건조하게 한 다음 다음 사용을 위해 다시 조립하십시오. 참고: 식증 챔버는 일회용으로 제조되지만 이 프로토콜에 설명된 대로 올바르게 처리및 세척하면 재사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Roush, D. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+primary+recovery:+centrifugation+and+membrane+technology.">Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology.</a> Biotechnology Progress. 24 (3), 488-495 (2008).</li><li>Hutchinson, N., Bingham, N., Murrell, N., Farid, S., Hoare, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+analysis+of+mammalian+cell+suspensions+for+prediction+of+industrial+centrifugation+and+its+verification.">Shear stress analysis of mammalian cell suspensions for prediction of industrial centrifugation and its verification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 95 (3), 483-491 (2006).</li><li>Shukla, A. A., Suda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Harvest and recovery of monoclonal antibodies: cell removal and clarification. Second ed. 2, 55-79 (2017).</li><li>Felo, M., Christensen, B., Higgins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+cost+and+facility+considerations+in+the+selection+of+primary+cell+culture+clarification+technology.">Process cost and facility considerations in the selection of primary cell culture clarification technology.</a> Biotechnology Progress. 29 (5), 1239-1245 (2013).</li><li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarification+of+recombinant+proteins+from+high+cell+density+mammalian+cell+culture+systems+using+new+improved+depth+filters.">Clarification of recombinant proteins from high cell density mammalian cell culture systems using new improved depth filters.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 1964-1972 (2013).</li><li>Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+and+purification+process+development+for+monoclonal+antibody+production.">Recovery and purification process development for monoclonal antibody production.</a> MAbs. 2 (5), 480-499 (2010).</li><li>Ryll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+small-scale+CHO+perfusion+cultures+using+an+acoustic+cell+filtration+device+for+cell+retention:+characterization+of+separation+efficiency+and+impact+of+perfusion+on+product+quality.">Performance of small-scale CHO perfusion cultures using an acoustic cell filtration device for cell retention: characterization of separation efficiency and impact of perfusion on product quality.</a> Biotechnology and Bioengineering. 69 (4), 440-449 (2000).</li><li>Gorenflo, V. M., Smith, L., Dedinsky, B., Persson, B., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-up+and+optimization+of+an+acoustic+filter+for+200+L/day+perfusion+of+a+CHO+cell+culture.">Scale-up and optimization of an acoustic filter for 200 L/day perfusion of a CHO cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 80 (4), 438-444 (2002).</li><li>Chitale, K., Lipkens, B., Presz, W., Desjardins, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+fluid+dynamics+associated+with+macro+scale+ultrasonic+separtors.">Understanding the fluid dynamics associated with macro scale ultrasonic separtors.</a> 169th Meeting of the Acoustical Society in America. , (2015).</li><li>Dionne, J., McCarthy, B., Ross-Johnsrud, B., Masi, L., Lipkens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+volume+flow+rate+acoustophoretic+phase+separator+for+oil+water+emulsion+splitting.">Large volume flow rate acoustophoretic phase separator for oil water emulsion splitting.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 133 (5), 3237 (2013).</li><li>Dutra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Macroscale+Acoustic+Device+for+Blood+Filtration.">A Novel Macroscale Acoustic Device for Blood Filtration.</a> Journal of Medical Device. 12 (1), 0110081-0110087 (2018).</li><li>Lipkens, B. E. M., Ross-Johnsrud, B., Presz, W. M., Chitale, K., Kennedy, T. J., Winiarski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+perfusion+devices.">Acoustic perfusion devices.</a> US patent. , (2017).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+envelope+identifies+broadly+neutralizing+human+monoclonal+antibodies+to+HIV-1.">Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1.</a> Science. 329 (5993), 856-861 (2010).</li><li>Shirgaonkar, I. Z., Lanthier, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+cell+filter:+a+proven+cell+retention+technology+for+perfusion+of+animal+cell+cultures.">Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures.</a> Biotechnology Advances. 22 (6), 433-444 (2004).</li><li>Wolf, M. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Performance+in+Mammalian+Cell+Perfusion+Cultures+by+Growth+Inhibition.">Improved Performance in Mammalian Cell Perfusion Cultures by Growth Inhibition.</a> Biotechnology Journal. 14 (2), 1700722 (2019).</li><li>Lin, H., Leighty, R. W., Godfrey, S., Wang, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+approach+to+developing+mammalian+cell+culture+media+for+high+cell+density+perfusion+process+leveraging+established+fed-batch+media.">Principles and approach to developing mammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveraging established fed-batch media.</a> Biotechnology Progress. 33 (4), 891-901 (2017).</li><li>Emily, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+clarification+of+very+high+cell+density+cell+culture+harvest+by+enhanced+cell+settling.">Primary clarification of very high cell density cell culture harvest by enhanced cell settling.</a> BioProcess International. 8, 32-39 (2010).</li></ol>

저자는이 원고에 설명 된 제품에 재정적 인 이익이 없으며 공개 할 다른 것은 없습니다.

설명된 것은 CHO 셀라인의 HCCF로부터의 모델 단일클론 항체의 1차 설명에서 벤치 스케일 AWS의 구현을 위한 단계별 프로토콜이다. 대표 결과에 나타난 바와 같이, 1차 설명에서 AWS를 사용하면 효과적인 셀 설명과 제품 복구가 발생했습니다. 또한 낮은 수준의 유지 보수 및 운영 요구 사항 및 확장 기능을 통해 기본 설명에서 더 넓은 응용 프로그램 잠재력을 제공합니다.
중요한 것은, 대표적인 결과는 공급 펌프 속도가 세포의 분리에 중요하다는 것을 건의합니다. 또한, 탁도 측정에서 높은 셀 밀도를 검출하는 데 있어 한계로 인해 작동 셀 밀도는 AWS 시스템을 사용할 때 고려해야 할 또 다른 요소입니다. 탁도 프로브는 높은 세포 밀도 사료 재료를 실행할 때 포화되기 때문에, 공급 재료의 세포 밀도를 측정하고 세포 배양 유체를 오프라인으로 명확히함으로써 세포 분리 효율을 계산하는 것이 가장 좋을 수 있다. 명확한 명확한 정확한 오프라인 측정을 통해 이러한 문제를 해결하는 데 고려될 수 있는 한 가지 공정 전략은 여러 챔버를 연속으로 사용하는 것입니다. 이 프로토콜은 주로 단일 챔버를 사용하는 데 초점을 맞추고 있지만,이 시스템은 세포의 상태에 최소한의 영향을 미치고 높은 제품 회수를 초래할 수있는 세포의 순차적 설명을 위해 세 개의 추가 챔버를 작동 할 수 있습니다. 또한 AWS 및 셀 제거 유량에 대한 전력과 같은 다른 매개 변수는 특정 셀 유형 또는 작동 모드에 더욱 최적화될 수 있습니다. 전반적으로 AWS 구현 전에 이러한 고려 사항을 사용하여 작업 매개 변수 및 전략을 최적화하는 것이 좋습니다.
많은 응용 분야 의 잠재력 중에서도 지속적인 바이오 프로세싱에서 AWS를 사용하는 것이 유망합니다. AWS는 원심분리를 대체하고 필터표면적(14)을대폭 줄일 수 있기 때문에 AWS를 사용하면 연속 적인 바이오 제조와 호환되는 후속 여과 및 크로마토그래피 공정을 위한 셀 프리 재료의 일정한 흐름을 가능하게 합니다. 이러한 호환성 및 고세포 밀도(예: >50 x 106 셀/mL) 및 더 긴 배양 기간(예: >14일)에 대한 관류 기술의 가용성으로 인해 AWS는 1차 설명 외에도 새로운 연속 세포 출혈 전략을 개발할 수 있습니다.
경우에 따라, 생성된 단백질 치료의 최대 30%는 세포 출혈물질(15,16)에서정상 상태 작동 중에 제거된다. 또한, 제거된 단일클론 항체가 표준 수확 물질로 풀링되려면 특정 품질 특성이 충족되어야 한다. 이러한 사양이 충족되지 않으면 제품 수율에 영향을 미칠 수 있는 재료의 거부가 발생할 수 있습니다. 이러한 제품 손실을 보상하기 위해 AWS를 이용한 셀 출혈 물질의 지속적인 설명은 장기 관류프로세스(17)동안 정상 상태로 구현될 수 있다. 이러한 전략은 출혈 물질의 제품 손실을 줄이고 생산된 단백질을 더 많이 활용할 수 있다. 또한 AWS를 이용한 지속적인 설명 후 세포는 더 높은 세포 밀도와 생산성을 위해 원하는 경우 생물 반응기에 다시 추가될 수 있습니다. 따라서 AWS를 사용하여 셀 출혈 재의 지속적인 설명은 주어진 공정에서 수율을 증가시키고/또는 이차 필터 표면적을 감소시킬 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다.
요약하면, AWS의 유틸리티는 간단한 기본 설명에 국한되지 않고 제조 속도와 운영 유연성을 향상시킬 수 있는 지속적인 바이오 프로세싱 응용 분야에 대한 유틸리티가 있을 수 있습니다.

분비 치료 단백질을 포함하는 바이오 제조 공정에서 중요한 단계는 수확 된 세포 배양액 (HCCF)에서 바이오 매스를 제거하는 것입니다. 전통적으로, 바이오 제조업체는 단일 클론 항체1의생산에 있는 그들의 1 차적인 해명 방법으로 심층 여과 다음 원심 여과를 채택했습니다. 그러나, 원심 분리는 세포에 높은 전단 응력으로 이끌어 낼 수 있습니다, HCCF에 있는 증가한 세포 파편의 결과로. 이것은 잠재적으로 여과 도중 필터 파울로 이끌어 내고 그 후에 다운스트림 크로마토그래피효율1,2,3을감소시킬 수 있는 추가 오염물질 후 여과귀 귀착될 수 있습니다. 또한 특정 공정에 대한 원심분리기의 사용자 지정비용이 많이 들 수 있으며 확장성을 제한하는 요인이 될 수 있는 클린-인-플레이스 시스템과 살균 시스템에 추가 연결이 필요할 수 있습니다. 깊이 필터를 사용하면 원심 분리의 한계를 보완하고 일회용 기술4를활용할 수 있습니다. 그러나 깊이 필터는 주로 높은 세포 배양 밀도5를견딜 수 없기 때문에 이차 설명으로 사용됩니다. 대안적으로, 접선 유량 여과(TFF) 세포 보존 장치는 전단 응을 완화하기 위해 사용되었지만 막 편광 및 가난한 수확 수율6과같은 어려움을 겪을 수 있다. 원심 분리 및 깊이 여과 또는 TFF의 사용으로 인해 발생하는 위의 문제는 HCCF의 1 차 설명 프로세스를 개선할 수있는 기회를 만듭니다.
음향 분리는 고품질 단백질 제품7,8을사용하여 세포 배양으로부터 분비된 단백질을 수확하는 데 활용할 수 있는 기술로 도입되었다. 음향 분리는 중단된 유체와 상호 작용하는 다차원 서파의 전파 및 반사를 통해 달성되고입자를 유지한 입자 9,10. 이 입자는 유체 드래그, 중력 및 음향 방사선의 세 가지 힘을 경험합니다. 각 힘이 동등하게 서로 반대하여 평형에 도달하면 입자가 일시 중단되어 초음파서파(10)내에 갇혀 있습니다. 세포 배양 현탁액에서, 세포는 서 있는 파의 이 압력 노드 평면 내에서 유지되고, 노드는 세포가 합쳐짐에 따라 증가하고, 결국 이러한 세포 노드 클러스터는 중력력9에서떨어진다. 이러한 퇴적된 세포는 매체에서 제거되어 명확히 된 매체를 펌핑하여 추가 다운스트림 처리를 위해 펌핑할 수 있습니다. 분리 방법으로 초음파의 활용은 지질 입자와적혈구(11)의 분리에서 포유류 관류 세포 배양에 이르는 생물학적 응용 분야로 변환하기시작했다. 원심분리, 깊이 여과 또는 TFF를 피함으로써 비용, 인건비 및 세포 스트레스를 줄이는 상대적인 기능을 갖춘 바이오 제조업체는 음향 분리를 사용하는 잠재적 인 응용 프로그램을 모색하고 있습니다.
이 연구는 CHO 세포 배양을 명확히 하기 위한 벤치탑 음향 파 분리기(AWS)를 운영하기 위한 일반적인 프로토콜을 제공하고, 대표 데이터를 제공하며, 효과적인 세포 설명 및 제품 회수를 달성하는 방법을 보여줍니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acoustophorectic chamber</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ActiCHO P</td>
			<td>GE</td>
			<td>SH31025.01</td>
			<td>powder medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AWS</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-SYS (60500101-SP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cadence Acoustic Separator Software</td>
			<td>Pall</td>
			<td>Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cells</td>
			<td>VRC</td>
			<td>VRC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Latitude 3470</td>
			<td>Windows 7, 64 bit OS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (70%)</td>
			<td>LabChem</td>
			<td>LC157605</td>
			<td>20L prepped 70% IPA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-CV</td>
			<td>200 mM stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S 14 tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96400-14</td>
			<td>peroxide-cured silicone tubing, 25ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S 16 tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96400-16</td>
			<td>peroxide-cured silicone tubing, 25ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing set</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-FP-K1 Tubing set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbidity probe</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-TS-S1 (60500106)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary clarification of cho harvested cell culture fluid using an acoustic separator

1차 해명은 수확된 세포 배양액 내에서 치료 제품으로부터 세포를 초기 제거하는 바이오 제조 공정에서 필수적인 단계이다. 원심분리 또는 여과와 같은 전통적인 방법은 세포 제거를 위해 널리 구현되지만, 이러한 프로세스의 장비는 큰 발자국을 가지고 있으며 작동에는 오염 위험과 필터 파울링이 포함될 수 있습니다. 또한, 전통적인 방법은 1 차적인 설명을 위한 연속적인 바이오 프로세싱 계획에 이상적이지 않을 수 있습니다. 따라서, 음향(sound) 파를 이용한 대체 어플리케이션은 세포 배양액으로부터 세포를 지속적으로 분리하는 것을 조사하였다. 본 연구에서 제시된 벤치 스케일 음향파 분리기(AWS)를 사용하여 CHO 세포 생물반응기 수확으로부터 단일클론 IgG1 항체를 함유하는 배양유체의 1차 분리를 위한 상세한 프로토콜이 있다. 대표적인 데이터는 AWS에서 제공되며 효과적인 셀 설명 및 제품 복구를 달성하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로 지속적인 바이오 프로세싱에서 AWS에 대한 잠재적 인 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 전반적으로, 이 연구는 CHO 세포 배양에 대한 기본 설명에서 AWS구현을 위한 실용적이고 일반적인 프로토콜을 제공하고 지속적인 바이오 프로세싱에서 애플리케이션 잠재력을 더 설명합니다.

프로토콜에 설명된 바와 같이, AWS는 그림 1에도시된 바와 같이 12.4 x 106 셀/mL의 밀도로 HCCF를 명확히 하는 데 사용되었습니다. 상기 사료 펌프는 3.5mL/min(5L/day)으로 설정되어, 10-20 L 배양에 적합한 범위 내에서 세포 출혈 속도를 나타내었다. HCCF가 AWS 챔버에 진입함에 따라 피드 탁도 프로브의 탁도 측정은 일관된 상태로 유지되었으며, 약 1,000-1,100 NTU, 프로브1 탁도 프로브의 측정은 NTU 40-50 NTU(그림8)에남아 있었습니다. 두 가지 측정을 사용하여 세포 제거 효율
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg">
계산및 평균 95%. 40-50 NTU의 탁도 측정은 달성 가능한 최소 탁도 수준이었기 때문에 시리즈의 추가 AWS 챔버에서 더 이상 분리할 수 없는 것으로 나타났습니다.
AWS는 낮은 유량으로 고효율로 분리할 수 있지만, HCCF를 챔버 내에서 더 오랜 시간 동안 유지하면 온도가 상승하여 낮은 유량을 선택할 때 고려해야 합니다. 도 9는 3.5mL/분의 공급 유속에서 수습 챔버및 음향 분리 후 HCCF의 온도 차이의 예이며, 이는 음향 챔버 내에서 장기간에 의한 온도의 >6°C 증가를 나타냈다.
높은 세포 밀도 수확 (즉, >20 x 106 세포/mL)을 실행할 때 또 다른 중요한 고려 사항은 탁도 프로브의 포화입니다. 사료 탁도 프로브에 대한 탁도 측정은 4,400NTU(도10)를통해 포화되어 세포 제거 효율 계산에서 과소 평가될 수 있다.
세포 설명에 대한 상이한 사료 속도의 효과를 테스트하기 위해 세포 제거 효율은 상이한 이송 속도로 측정되었습니다. 도 11에도시된 바와 같이, 사료 펌프 속도가 증가함에 따라 세포 제거 효율이 ~100%에서 57%로 크게 감소하였다. 일반적으로, 공급 펌프 속도가 느려질수록 세포 설명이 더 좋습니다. 그러나 각 응용 프로그램에 대해 피드 속도를 최적화하는 것이 좋습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig01.jpg"> 그림 1: AWS 설정. 펌프가소프트웨어(a)로켜지면 HCCF는 피드 튜탁프로브(c)를통해 피드펌프(b)를통해 서투하여 AWS챔버(d)로채널화하였다. 챔버 내부, 음향 힘은 파도의 노드의 흐름에서 세포를 갇혀 응집발생. 부력 감소로 세포는 중력을 통해 떨어지게 하고, 세포는 1단계펌프(e)를통해 세포 수확병(f)을 통해 아쿠스토포레틱 챔버의 폐포트에서 제거되었고, 명확한 물질은 챔버의 침투포트를 통해 프로브1 탁도 프로브(c)로 빠져나와 제품 수확병(g)으로 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig02.jpg"> 그림 2: AWS 시스템 뒤로. 탁도 프로브와 챔버는 탁도 프로브이더넷(a)및 챔버 전원 BNC(b) 케이블을 통해AWS 시스템 뒷면의 각 포트에 연결됩니다. 또한 컴퓨터는 PC 이더넷케이블(c)을통해 연결됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig03.jpg"> 그림 3: 탁도 프로브 및 하우징. 각 탁도프로브(a)는각각의 탁도 계수 및 온도계 하우징(b)에 적절히 삽입되고 나사로 조여져야 한다. 챔버 전원 BNC 케이블(c)은챔버내의 압제 트랜스듀서가 유체로 채워진 후에만 수선식 챔버(d)의뒷면에 연결되어야합니다. 프로브는 다음과 같이 표시됩니다 : F = 피드 탁도, 1 = 프로브1 탁도, 2, 3 및 4는 사용되지 않는 프로브 (또는 절차를 직렬화하는 데 사용할 수 있음). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig04.jpg"> 그림 4: 탁도 하우징과 축전 챔버 사이의 연결. 피드 튜브는 피드 펌프를 통해 사료 탁도포트(a)의입력에 연결됩니다. 사료 탁도포트(b)의출력은 y-튜브를 통해 유상증실(c)의입구 포트에 연결된다. stage1 튜브는 단계1 펌프를 통해 수거 용기에 대한 수중식챔버(d)의폐기물 포트에서 연결된다. 축축챔버(e)의 침투포트는 프로브1 탁도 포트(f)의 입력에 연결된다. 수확 튜브는 프로브1 탁도 포트(g)에서 제품 수집 용기로 연결됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig05.jpg"> 그림 5: 음향 분리기 소프트웨어의 판독 패널입니다. 이 프로그램에는"판독"및"컨트롤"이라는두 개의 패널이 있습니다. "판독"패널 내에서, 탁도(a),온도(b),및 백분율감소(c)가모니터링된다. 데이터 녹화를 시작하려면"시작 테스트"버튼(d)을클릭해야 하며 버튼의 색상을 녹색으로 변경합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig06.jpg"> 그림 6: 프로그램의 패널을 제어합니다. "컨트롤"패널 내에서 펌프를 켜거나 끌 수 있으며, 펌핑 속도를사료(a)및 기타단계(b)에대해 변경할 수 있다. 또한, 압전 트랜스듀서의 챔버 전원을 켜거나 끌 수있으며(c)슬라이드바(d)로변경할 수 있다. 이 실험은 제조업체에서 권장하는 CHO 셀에 권장되는 전원 설정이기 때문에 10W를 사용했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig07.jpg"> 그림 7: AWS 챔버. 세포가 챔버 내부에 들어가면 음향 력은 파도 노드에 세포를 갇혀 세포가 클러스터 (a)를 발생시켰습니다. 이 세포 클러스터는 부력을 잃고 결국 중력에 의해 정착 될 때까지 크기가 증가 (b). 다음으로, 정착된 세포는 1단계 펌프를 통해 수선식 챔버의 폐포트에서 세포 수확병(c)으로 제거되었다. 제품은 침투 포트 (d)를 통해 챔버를 빠져 나간 반면 HCCF는 입구 포트 (e)를 통해 챔버를 지속적으로 채웠다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig08.jpg"> 그림 8: 공급 펌프 비율이 3.5mL/min인 12 x 106 셀/mL CHO 세포 배양에 대한 탁도 측정. 사료 탁도(파란색)는 약 1,000NTU였고 스테이지 1 탁도미터(주황색)를 빠져나가는 침투는 40-60 NTU였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig09.jpg"> 그림 9: 3.5mL/분의 이송 펌프 비율을 가진 12 x 106 셀/mL CHO 세포 배양에 대한 온도 측정. 사료 온도(blue)는 약 21°C였으며 스테이지 1 탁도미터(orange)를 빠져나가는 침투는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig09large.jpg" target="_blank"></a> 약 27°C였다.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig10.jpg"> 도 10: 높은 세포 밀도 샘플에 대한 탁도 측정 예. 세포 밀도가 >20 x 106 셀/mL일 때, 사료 탁도 측정은 4,400 NTU의 최대 값으로 포화되어 세포 제거 효율을 과소평가하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig11.jpg"> 그림 11: 세포 제거 효율 비교. 사료 속도가 증가함에 따라 세포 분리가 감소했습니다. 따라서 사료 속도가 증가함에 따라 세포 설명 효율이 감소했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig11large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>매개 변수</td>
			<td>사양</td>
		</tr>
<tr>
<td>유량</td>
			<td>0 – 10 L/h</td>
		</tr>
<tr>
<td>압력 범위</td>
			<td>0 – 2 바 (0 - 30 psi)</td>
		</tr>
<tr>
<td>체온 을 먹이</td>
			<td>0 – 40 °C (32 - 104 ° F)</td>
		</tr>
<tr>
<td>작동 온도</td>
			<td>0 – 40 °C (32 - 104 ° F)</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 작동 조건. 유량, 압력 범위, 공급 유체 및 작동 온도를 위한 AWS 제조업체의 권장 작동 조건입니다.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator at JoVE.com

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

여기에 제시된 음향 분리기사용CHO세포배양의 1차 해명에 대한 프로토콜이 있다. 이 프로토콜은 쉐이크 플라스크 배양 또는 생물 반응기 수확의 1 차적인 설명을 위해 사용될 수 있고 관류 생물 반응기 작업 도중 세포 출혈 물질의 지속적인 설명을 위한 잠재적인 응용을 가지고 있습니다.

음향 분리기사용 CHO 수확세포 배양액의 1차 해명

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

primary-clarification-cho-harvested-cell-culture-fluid-using-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

5.0K 조회수.  U.S. Food and Drug Administration. 여기에 제시된 음향 분리기사용CHO세포배양의 1차 해명에 대한 프로토콜이 있다. 이 프로토콜은 쉐이크 플라스크 배양 또는 생물 반응기 수확의 1 차적인 설명을 위해 사용될 수 있고 관류 생물 반응기 작업 도중 세포 출혈 물질의 지속적인 설명을 위한 잠재적인 응용을 가지고 있습니다.

비디오: Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

어쿠스틱 막 Microparticle 기술을 사용하여 개발 사용자 지정 중국어 햄스터 난소 - 숙주 세포의 단백질 Assays

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

연구

생체공학

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level. However, this is not easily achieved because the small amount of labile mRNA present in a single cell (1-5% of 1-50pg total RNA, or 0.01-2.5pg mRNA, per cell 1) mostly degrades before it can be reverse transcribed into a stable cDNA copy. For example, using standard laboratory reagents and hardware, only a small number of genes can be qualitatively assessed per cell 2. One way to increase the efficiency of standard laboratory reverse transcriptase (RT) reactions (i.e. standard reagents in microliter volumes) comprising single-cell amounts of mRNA would be to more rapidly mix the reagents so the mRNA can be converted to cDNA before it degrades. However this is not trivial because at microliter scales liquid flow is laminar, i.e. currently available methods of mixing (i.e. shaking, vortexing and trituration) fail to produce sufficient chaotic motion to effectively mix reagents. To solve this problem, micro-scale mixing techniques have to be used 3,4. A number of microfluidic-based mixing technologies have been developed which successfully increase RT reaction yields 5-8. However, microfluidics technologies require specialized hardware that is relatively expensive and not yet widely available. A cheaper, more convenient solution is desirable. The main objective of this study is to demonstrate how application of a novel "micromixing" technique to standard laboratory RT reactions comprising single-cell quantities of mRNA significantly increases their cDNA yields. We find cDNA yields increase by approximately 10-100-fold, which enables: (1) greater numbers of genes to be analyzed per cell; (2) more quantitative analysis of gene expression; and (3) better detection of low-abundance genes in single cells. The micromixing is based on acoustic microstreaming 9-12, a phenomenon where sound waves propagating around a small obstacle create a mean flow near the obstacle. We have developed an acoustic microstreaming-based device ("micromixer") with a key simplification; acoustic microstreaming can be achieved at audio frequencies by ensuring the system has a liquid-air interface with a small radius of curvature 13. The meniscus of a microliter volume of solution in a tube provides an appropriately small radius of curvature. The use of audio frequencies means that the hardware can be inexpensive and versatile 13, and nucleic acids and other biochemical reagents are not damaged like they can be with standard laboratory sonicators.

We describe a novel method for increasing cDNA yield from single-cell quantities of mRNA in otherwise standard laboratory reverse transcription reactions. The novelty resides in the use of a micromixer, which utilizes the phenomenon of acoustic microstreaming, to mix fluids at microliter scales more effectively than shaking, vortexing or trituration.

어쿠스틱 Microstreaming를 사용하여 표준 실험실 역방향 Transcriptase 반응에서 mRNA의 단일 세포로부터 cDNA 수량 산출 증가

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

종양 세포 침략에 중간 유체 흐름의 효과를 측정하는 세 가지 차원 세포 배양 모델

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

미세 유체 흐름 챔버 지혈 및 혈소판 수혈을 모델링하기 위해 재구성 된 혈액을 사용하여<em&gt; 체외</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing drugs targeted at the liver, requires a platform in which cells receive proper biochemical and mechanical cues. Recent liver tissue engineering systems have employed three-dimensional (3D) scaffolds composed of synthetic or natural hydrogels, given their high water retention and their ability to provide the mechanical stimuli needed by the cells. There has been growing interest in the inverted colloidal crystal (ICC) scaffold, a recent development, which allows high spatial organization, homotypic and heterotypic cell interaction, as well as cell-extracellular matrix (ECM) interaction. Herein, we describe a protocol to fabricate the ICC scaffold using poly (ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) and the particle leaching method. Briefly, a lattice is made from microsphere particles, after which a pre-polymer solution is added, properly polymerized, and the particles are then removed, or leached, using an organic solvent (e.g., tetrahydrofuran). The dissolution of the lattice results in a highly porous scaffold with controlled pore sizes and interconnectivities that allow media to reach cells more easily. This unique structure allows high surface area for the cells to adhere to as well as easy communication between pores, and the ability to coat the PEGDA ICC scaffold with proteins also shows a marked effect on cell performance. We analyze the morphology of the scaffold as well as the hepatocarcinoma cell (Huh-7.5) behavior in terms of viability and function to explore the effect of ICC structure and ECM coatings. Overall, this paper provides a detailed protocol of an emerging scaffold that has wide applications in tissue engineering, especially liver tissue engineering.

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

반전 콜로이드 결정체 폴리 (에틸렌 글리콜) 비계의 제작 : 간 조직 공학을위한 삼차원 세포 배양 플랫폼

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

제조 및 통합된 전극 Transendothelial 전기 저항을 직접 측정 하는 기관-온-칩 시스템의 유효성 검사

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process involves seeding of epithelial cells sparsely in a 3D matrix gel on a 96-well microplate with media changes to cultivate expansion into organoids. Morphology is then assessed by whole-well capturing of z-stack images. Compression of z-stacks creates a single in-focus image from which organoids are measured to quantify a variety of outputs, including circularity, roundness, and area.DNA, RNA, and protein can be collected from organoids recovered from the matrix gel. Cell populations of interest can be assessed by organoid dissociation and flow cytometry. Formalin-fixation-paraffin-embedding (FFPE) followed by sectioning is used for the histological assessment and antibody staining. Whole-mount immunofluorescent staining preserves organoid morphology and facilitates observation of protein localization in organoids in situ. Commercial assays that are traditionally used for 2D monolayer cells can be modified for 3D organoids. Used together, the techniques in this protocol provide a robust toolbox to quantify prostate organoid growth, morphologic characteristics, and expression of differentiation markers.

Here, we present a protocol to guide human primary prostate organoid handling then suggest endpoints to assess phenotype. Seeding, culture maintenance, recovery from matrix gel, morphologic quantification, embedding and sectioning, FFPE sectioning, whole-mount staining, and application of commercial assays are described.

처리 및 인간의 기본 전립선 Organoid 문화에 대 한 평가

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various biological activities including cell proliferation, survival, migration and differentiation. Several aberrations in the FGFR signaling pathway, owing to mutations or gene amplification events, have been identified in various types of cancers. Hence, recent research has focused on developing strategies involving therapeutic targeting of FGFRs. Current FGFR inhibitors at various stages of pre-clinical and clinical development include either small molecule inhibitors of tyrosine kinases or monoclonal antibodies, with only a few peptide- based inhibitors in the pipeline. Here, we provide a protocol using phage display technology to screen small peptides as antagonists of FGFR2. Briefly, a library of phage-displayed peptides was incubated in a plate coated with FGFR2. Subsequently, unbound phage was washed off by TBST (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20), and bound phage was eluted with 0.2 M glycine-HCl buffer (pH 2.2). The eluted phage was further amplified and used as input for the next round of biopanning. Following three rounds of biopanning, the peptide sequences of individual phage clones were identified by DNA sequencing. Finally, the screened peptides were synthesized and analyzed for affinity and biological activity.

Herein, we present a detailed protocol for screening small peptides that bind to FGFR2 using a phage display peptide library. We further analyze the affinity of the selected peptides toward FGFR2 in vitro and its ability to suppress cell proliferation.

파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용하여 섬유아세포 성장 인자 수용체2를 표적으로 하는 소형 펩타이드의 스크리닝 및 식별

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Y-27632를 사용하여 1차 인간 칭기발 상피 세포의 격리 및 배양

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...