전립선 오르가노이드는 발달과 질병을 공부하기위한 생체 외 시스템입니다. 그들은 불멸의 세포주 문제를 극복하고 동물 모델에 대한 저렴한 대안을 제공합니다. 그(것)들은 인간적인 전립선 세포에서, 우리가 이 프로토콜에서 보여주었듯이, 마우스 전립선 세포, 질병 관련 전 임상 모형 시스템으로, 성장될 수 있습니다.
많은 실험실에서 유용한 문화 권 법과 끝점을 설명했습니다. 그러나 우리는 하나의 프로토콜에 이러한 세부 사항을 함께 가져와 새로운 사용자를위한 특히 어려운 단계를 보여 줄 수 있기를 바랍니다. 기술이 향상됨에 따라 전립선암 오르가노이드는 환자 샘플에서 치료 에 대한 모델 및 반응에 대한 정밀 의학 접근법으로 재배될 수 있습니다.
배양 조건은 전립선 오르가노이드에 특정, 그러나 끝점의 많은 다른 조직 유형에서 적응 되었습니다. 사용자는 이 프로토콜의 일부를 셀 유형의 관심에 맞게 조정할 수 있습니다. 원고에 설명된 바와 같이 매트릭스 겔 코딩 96-웰 플레이트에서 상피 세포를 성장시킴으로써 이 실험을 시작합니다.
12 일 후에 플레이트에서 오르가노이드를 수집하려면 매트릭스 젤을 방해하지 않고 우물에서 배지를 제거하십시오. 그런 다음 즉시 약 200 마이크로리터의 중성 프로테아제에 매트릭스 겔의 1 대 2 비율로 중성 프로테아제에 대해 잘 첨가하십시오. 섭씨 37도에서 20분 동안 접시를 배양합니다.
그런 다음 파이펫을 위아래로 위아래로 사용하여 혼합물을 기계적으로 분리하고 섭씨 37도에서 20 분 동안 다시 배양합니다. 인큐베이션 후, 중성 프로테아제 매트릭스 젤 세포 혼합물을 몇 가지 우물에서 마이크로센트심리립지 튜브로 이송한다. 3~5분 동안 300배 g의 원심분리로 세포를 펠렛합니다.
상체를 제거하고 후속 분석을 위해 오르가노이드 펠릿을 저장합니다. 포함형 금형을 만들려면 1, 000 마이크로리터 파이펫 팁의 작은 부분을 잘라 50 마이크로리터를 보유한 실린더를 만듭니다. 그런 다음 동일한 팁의 넓은 부분에서 첫 번째 금형 주위에 맞는 두 번째 더 넓은 금형을 만듭니다.
차가운 블록을 만들려면 접착제 면으로 아이스팩을 테이프로 감쌉니다. 그런 다음 금형을 테이프에 수직으로 부착합니다. 처리를 위한 조직학 젤 플러그에 오르가노이드를 포함하기 위하여, 먼저 행크의 균형 잡힌 소금 용액의 1 밀리리터로 이전에 얻은 오르가노이드 펠릿을 세척하십시오.
3~5분 동안 300배 g에서 원심분리한 후 상체를 제거합니다. 그런 다음 30~50마이크로리터의 액체 조직학 젤을 오르가노이드 펠릿에 넣고 천천히 위아래로 배관하여 부드럽게 섞어 펠릿을 재보펜합니다. 이 혼합물을 콜드 블록의 금형으로 옮기고 시편이 냉각되어 플러그로 응고할 수 있도록 합니다.
다음으로 플런저를 사용하여 작은 금형의 플러그를 더 큰 금형의 중심으로 밀어 내고 플러그 주위에 2% 한고를 투명하게 피펫팅하여 채웁니다. 샘플의 상단을 표시하려면 플러그 위에 파이펫 히스토알로이트 염색 2% 천을 표시합니다. 한천이 식으면 플런저를 사용하여 플러그를 히스토로지 카세트로 옮길 수 있습니다.
카세트를 연필로 라벨로 붙이고 10% 중성 버퍼링 된 포르말린에 넣고 하룻밤 고정하십시오. 다음 날, 카세트를 10% 중성 완충 포르말린에서 70%의 조직학 등급 에탄올로 옮기고, 카세트를 더 처리하고 파라핀에 포함시켰다. 먼저 블록의 베이스를 10 마이크로미터 두께로 트리밍합니다.
플러그 영역이 포함된 섹션이 나타나면 트리밍을 중지합니다. 마이크로톤 로터를 잠그고 블록을 얼음으로 다시 옮겨 서늘하게 합니다. 블레이드를 사용하지 않은 새 부분으로 이동합니다.
그리고 블록을 다시 클램프로 옮기습니다. 기기의 잠금을 해제하고 섹션당 5마이크로미터로 트리밍을 시작합니다. 핀셋을 사용하여 섹션을 섭씨 40도의 수조로 옮기고 확산되도록 하십시오.
슬라이드를 물에 수직으로 찍어 섹션을 위로 옮깁니다. 그런 다음 밝은 필드 현미경 아래에서 슬라이드를 관찰하여 오간노이드가 섹션에 있는지 확인합니다. 하룻밤 사이에 섭씨 45~50도에서 구운 다음 원고에 설명된 대로 염색을 진행합니다.
오가노이드가 있는 96웰 매트릭스 젤 코팅 플레이트의 사용하지 않은 우물로 실험의 이 부분을 시작합니다. 우물의 측면에 대해 파이프를 하여 미디어와 매트릭스 젤 사이의 공간을 남기고, 유기성 문화를 방해하지 않고 가능한 한 많은 미디어를 조심스럽게 제거하십시오. 1, 000 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 PBS로 미리 젖어 관심 있는 오르가노이드를 함유한 매트릭스 젤 한 방울을 그립니다.
챔버 슬라이드의 중간에 드롭을 분배합니다. 육안으로, 미세 한 파이펫을 사용하여 챔버 슬라이드에서 여분의 미디어와 매트릭스 젤을 흡인. 유리에 오르가노이드 준수를 촉진하고 후속 세척 단계 동안 샘플의 손실을 방지합니다.
슬라이드를 섭씨 37도 인큐베이터에 30~45분간 배치합니다. 접시에서 분리를 방지하기 위해 천천히 파이프, 부드러운 흔들림과 실온에서 5 분 동안 오르가노이드를 세척하는 1X PBS의 200 마이크로 리터를 추가합니다. 조심스럽게 1X PBS를 제거하고 4 %의 파라 포름 알데히드의 200 마이크로 리터를 추가합니다.
부드러운 흔들림으로 실온에서 30분 간 고정하십시오. PFA에서, 세척하고 이 프로토콜에 의해 설명된 대로 후속 투과화 및 염색 단계를 진행합니다. 즉시 마운트 및 이미지.
얼룩이 없는 갓 잘라낸 슬라이드는 인간의 1차 전립선 비건구를 명확하게 보여주는 반면, 염색되지 않은 드라이 슬라이드에서는 오르가노이드가 반투명하게 나타나고 밝은 필드 현미경으로 감지하기가 더 어렵습니다. Hematoxylin 및 eosin 염색은 잘 처리된 오르가노이드에 비해 공격적인 파이펫팅, 잘못된 처리 프로토콜과 같은 잘못된 취급에서 깨진 인간 1차 전립선 오르간로이드를 보여줍니다. 인간 1차 전립선 오르간노이드는 포르말린 고정, 파라핀 임베디드, 단면, 기저 사이토케라틴 5 및 발광 사이토케라틴 8, 기저 p63 및 발광 사이토케라틴 8으로 염색되었으며, 공초점 현미경으로 이미지화되었다.
전체 장착 된 인간 기본 전립선 오르간노이드는 기저 사이토케라틴 5 또는 발광 사이토케라틴 8으로 염색되었으며, phalloidin및 DAPI로 대응하고 공초점 현미경으로 이미지화되었습니다. 전체 장착 된 인간 1 차 전립선 세포 오르가노이드는 형광 라벨 에듀로 염색하고 Hoescht로 반소하고 공초점 현미경으로 이미지화되었습니다. 절차 전반에 걸쳐 오르가노이드를 시각화하는 것이 중요합니다.
섹션을 수집한 후 슬라이드의 샘플을 시각화하고 전체 장착 중에 오르가노이드를 관찰해야 합니다. 매트릭스 젤에서 오르가노이드를 수집한 후, 이를 전체적으로 마운트하고 상업적 분석서를 사용하거나 유동 세포 분석 또는 단일 세포 시퀀싱을 위해 단일 세포로 해리할 수 있습니다. 3D 배양은 연구자들이 실험실 접시의 설정에서 조직을 연구하는 새로운 방법을 제공합니다.
그것은 유기 발생에 적용 될 수있다, 또는 환자의 질병의 병리를 이해. 환자 샘플로 작업 할 때, 항상 주의를 기울이고 혈액 매개 병원체 노출의 가능성으로 재료를 처리합니다.
