저자는 살모넬라 LAMP 방법 검증 연구를 비판적으로 검토하기 위한 FDA의 미생물학 방법 검증 소위원회 (MMVS) 및 세균성 분석 매뉴얼 (BAM) 위원회의 회원들에게 감사드립니다.

<ol>
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저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다. 이 원고에 표현 된 견해는 저자의 견해이며 반드시 보건 복지부, 미국 식품 의약국 또는 미국 정부의 공식 정책을 반영하지 는 않습니다. 식품의약품안전청의 승인, 보증 또는 권고에 따라 상업적 재료, 장비 또는 공정에 대한 언급은 어떠한 방식으로도 구성되지 않습니다.

동물성 음식과 순수한 문화에서 살모넬라를 선별하고 확인하는 간단하고 신속하고 구체적이며 민감한 LAMP 방법을 소개했습니다. 4개의 키 시약이 포함된 이더스말 마스터 믹스의 편리함과 함께, 기성용, 사내 준비된 프라이머 믹스, LAMP 반응을 조립하려면 몇 개의 파이펫팅단계(도 1)만필요하다. 증폭 및 음막 단계를 포함한 총 실행 시간은 38분 미만입니다(그림2A, B 및 도 3A, B). 양수 결과는 실시간 형광(도2C 및 도 3C,D)을통해 모니터링되며 5분26분으로조기에 검출될 수 있다. 멸음 단계는 정확한 Tm(약 90°C)을 가진 샘플만 양성(도2D, E 및 도 3E−G)으로보고되기 때문에 LAMP 특이성의 추가 확인 역할을 한다. 순수한 배양에서 살모넬라 세포 1개 및 동물사료의 CFU/25 g1의 민감성은 이전에26개에보고되었다.
LAMP는 매우 효과적이며 다량의 DNA1을생성하기 때문에, 최고의 실험실 관행은 가로등 마스터 믹스를 준비하고 DNA 템플릿을 추가하기 위한 영역을 물리적으로 분리하고, 에어로졸 생성을 피하고, 필터 파이펫 팁을 사용하고, 장갑을 자주 변경하고, 증폭 후 LAMP 반응 튜브를 열지 않도록 하는 것을 포함하는 교차 오염을 방지하는 데 가장 좋은 실험실 관행을 사용하는 것이 중요합니다.
본 살모넬라 LAMP 방법의 특이성은 이전에 300개의 세균균종(185개의 세로바르의 살모넬라 247개 및 53개의비살모넬라)을사용하여 시험하고 100% 특이적26인것으로 나타났다. 특히, T맥스의 현저한 차이는 두 살모넬라종, S. 엔테리카와 살모넬라 봉고리,그리고 S. 엔테리카 아종, 특히 아취종(IIIa)26종사이에서 관찰되었다. 그럼에도 불구하고, 이들은 여전히 LAMP 결과를 해석하기위한 규칙에 따라 유효한 긍정적 인 결과였다. 14명의분석가19명이참여한 건식 개 사료에 대한 다연구소 협력 연구에서 중복 램프 런에서 일관되지 않은 결과를 갖는 샘플이 때때로 관찰되었습니다. 이들은 일반적으로 지연된 양성 결과를 가진 견본을 관련시켰습니다(Tmax > 15 분). 두 실행 모두 독립적으로 반복하여 일반적으로 문제를 해결했습니다. 더 드물게 정확한Tm을 가진 샘플을 관찰했지만 불규칙한 T최대 값(&lt; 5분)이 없습니다. 이것은 일반적으로 반응 관에 있는 기포에 기인했습니다.
LAMP 방법의 수명주기 전반에 걸쳐 다양한 동물성 식품 또는 식품 매트릭스 및 배양 매체4,19,22,23,24에서램프의 억제제에 대한 높은 관용을 관찰하여, 방법의 견고성을 강조하고 글로벌 스케일8에대한 수많은 다른 연구를 협력하였다. 이는 일반적으로 부정적인 결과가 매트릭스억제(28)로인한 것이 아님을 보장하기 위해 내부 증폭 제어가 필요한 PCR 또는 실시간 PCR에 비해 우수하다. 또한, LAMP는 대부분의 연구에서 PCR 또는 실시간 PCR에 비해 유사한(또는 우수한) 특이성 및민감도를 입증하였다 8. LAMP 시약의 비용은 반응 당 약 $1입니다. 이 프로토콜에 사용되는 LAMP 계측기는 작고 유지 보수가 적으며 휴대용입니다. 그들은 형광 측정, LAMP 포함에 의해 표적 검출을 사용하는 모든 이체 증폭 방법을 처리 할 수 있습니다. LAMP 소프트웨어를 사용하면 포괄적인 보고서를 여러 형식(pdf, 텍스트 및 이미지)으로 생성할 수 있습니다.
메서드 유효성 검사는 일상적인 사용을 위해 새 메서드를 채택하기 전에 중요한 단계입니다. 여기에 보고된 LAMP 프로토콜이 다중 실험실 유효성검사(19)를성공적으로 완료했다는 점은 주목할 만하다. 최근 미국 FDA의 BAM 챕터 5 살모넬라27에이 LAMP 프로토콜이 통합됨에 따라 동물사료의 신속한 선별 방법과 모든 식품 범주에서 분리된 추정 살모넬라 분리를 위한 신뢰할 수 있는 확인 방법으로 훨씬 더 폭넓게 사용될 것으로 기대된다.

루프 매개 이더스말 증폭(LAMP)은 일본 과학자1의그룹에 의해 2000년에 발명된 새로운 이더실 핵산 증폭 시험(iNAAT)이다. 초기 단계에서 표적 특이적 줄기 루프 DNA 구조의 형성을 통해 LAMP는 가닥 변위 DNA 폴리머라아제를 사용하여 이 시작 물질준기하수수체를 효율적으로 증폭시켜 1h1미만의 표적109카피를 생성한다. 널리 사용되는 NAAT인 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 비교하여 LAMP는 몇 가지 장점을 가지고 있습니다. 첫째, 램프 반응은 이소성 조건하에서 수행됩니다. 이것은 정교한 열 사이클링 장비의 필요성을 없애. 둘째, LAMP는 임상 및 식품 응용 분야3,4모두에 대해 입증된 견고성을 갖춘 배양 매체 및 생물학적 물질2에 매우관대하다. 이렇게 하면 샘플 준비를 단순화하고 잘못된 음수 결과5를최소화합니다. 셋째, LAMP는 탁도, 색도, 생물발광, 형광, 및미세유체6와같은 다중 검출 플랫폼에 순종한다. 넷째, LAMP는 특별히 설계된 프라이머 4~6개에 사용하여 6~8개의 특정 영역1,7을대상으로 하기 때문에 매우 특이적이다. 다섯째, LAMP는 매우 민감하며 수많은 연구에서 PCR 또는 실시간 PCR8에대한 우수한 민감성을 보고했습니다. 마지막으로, LAMP는 PCR 형 분석이 일반적으로 1-2 h8을취하는 동안 30 분 표준 런타임을 채택하는 많은 분석으로 빠릅니다.
이러한 매력적인 특징은 체외 진단9,동물질환 진단10,식품 및 환경 검사11을포함한 광범위한 병원체 검출 영역에서 LAMP의 적용을 촉진시켰다. 특히, 결핵결핵을 위한결핵(LAMP)은 WHO가 말초 설정에서 폐결핵 진단을 위한 가래-얼룩 현미경검사에 대한 유효한 대체 시험으로서 추천되었다(12) LAMP 응용 프로그램은 또한 알러지 유발 물질, 동물 종, 약물 내성, 유전자 변형 유기체 및 살충제13의검출을 포함하도록 미생물 식별을 넘어 확장됩니다.
nontyphoidal 살모넬라는 전 세계적으로14의실질적인 식품 안전 및 공중 보건 문제의 동물성 병원체입니다. 또한 동물(즉, 동물성 식품)15,16을위한 식품의 중요한 미생물 위험으로 확인되었다. 살모넬라 병/발병이 오염된 인간 음식과 동물 사료로부터 발생하지 않도록 하기 위해 다양한 행렬에서 살모넬라를 테스트하기 위한 신속하고 신뢰할 수 있으며 강력한 방법을 갖는 것이 필수적입니다. 지난 10 년 동안, 최근 광범위한 검토8에요약된 바와 같이, 다양한 식품 행렬에서 살모넬라 LAMP 에세이의 개발 및 적용에 국제적으로 상당한 노력이 이루어졌습니다. 여기에 제시된 것을 포함하여 몇몇 살모넬라 LAMP 소는,잘 확립된 국제 지침17,18,19,20에따라 다중 실험실 검증을 성공적으로 완료했습니다.
당사의 살모넬라 램프 분석은 특별히 살모넬라 침공 유전자 invA(GenBank 가입 번호 M90846)21을 대상으로 하며, 여러 식품 행렬4,22,23,24,25,26에서빠르고 신뢰할 수 있고 견고하다. 이 방법은 사전 협업 연구26및 다연구소 협력 연구에서 건식 개사료(19)에서6개의 동물사료 행렬에서 검증되었다. 그 결과, 여기에 제시된 살모넬라 램프 방법은 최근 미국 식품의약국(FDA)의 세균성 분석 매뉴얼(BAM) 제5장 살모넬라(27)에 통합되어 동물식품에 살모넬라의 존재에 대한 신속한 검진 방법으로, 2개는 모든 식품에서 분리된 살모넬라를 위한 신뢰할 수 있는 확인 방법으로 사용된다.

<table><tbody><tr><td>Brain heart infusion (BHI) broth</td><td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td><td>299070</td><td>Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.</td></tr><tr><td>Buffered peptone water (BPW)</td><td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td><td>218105</td><td>Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples.</td></tr><tr><td>DNA AWAY</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>7010</td><td>Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples.</td></tr><tr><td>Genie Explorer software</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td><td>Version 2.0.6.3</td><td>Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis.</td></tr><tr><td>Genie II or Genie III (LAMP instrument)</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td><td>GEN2-02 or GEN3-02</td><td>A small instrument capable of temperature control up to 100 &amp;deg;C with &amp;plusmn; 0.1 &amp;deg;C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples.</td></tr><tr><td>Genie strip</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td><td>OP-0008</td><td>8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 &amp;micro;l.</td></tr><tr><td>Genie strip holder</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td><td>GBLOCK</td><td>Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block.</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SA48-500</td><td>Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.</td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>88-860-022</td><td>Heats samples at 100 &amp;plusmn; 1 oC for DNA extraction.</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>3960</td><td>Standard laboratory incubator.</td></tr><tr><td>ISO-001 isothermal master mix</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td><td>ISO-001</td><td>An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel).</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>A416</td><td>Disinfects work surfaces.</td></tr><tr><td>LAMP primers</td><td>Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA</td><td>Custom</td><td>LAMP primers with detailed information in Table 1.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf North America, Hauppauge, NY</td><td>22620207</td><td>MiniSpin plus personal microcentrifuge.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>05-408-129</td><td>Standard microcentrifuge tubes.</td></tr><tr><td>Molecular grade water</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>AM9938</td><td>Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix.</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SS266-1</td><td>Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.</td></tr><tr><td>Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>R01202</td><td>Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella.</td></tr><tr><td>Peptone water</td><td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td><td>218071</td><td>Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA.</td></tr><tr><td>Pipettes and tips</td><td>Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA</td><td>Pipet Lite LTS series</td><td>Standard laboratory pipettes and tips.</td></tr><tr><td>PrepMan Ultra sample preparation reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>4318930</td><td>A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction.</td></tr><tr><td>Salmonella reference strain LT2</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td>700720</td><td>Salmonella reference strain used as positive control.</td></tr><tr><td>Trypticase soy broth (TSB)</td><td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td><td>211768</td><td>Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY</td><td>SI-0236</td><td>Standard laboratory vortex mixer.</td></tr><tr><td>Whirl-pak filter bag</td><td>Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI</td><td>B01318</td><td>Filter bags to hold animal food samples for preenrichment.</td></tr></tbody></table>

loop-mediated isothermal amplification for screening salmonella in animal food and confirming salmonella from culture isolation

루프 매개 이더스말 증폭(LAMP)은 수많은 세균성, 곰팡이, 기생및 바이러스 성 제제의 신속한 검출을 위한 강력한 핵산 증폭 시험으로 부상하고 있다. 살모넬라는 동물을 위한 음식을 포함하여 세계적인 음식 안전 관심사의 세균성 병원체입니다. 여기에 제시된 다중 실험실 검증 살모넬라 LAMP 프로토콜은 살모넬라 오염의 존재를 위해 동물 사료를 신속하게 선별하는 데 사용될 수 있으며 모든 식품 범주에서 회수된 추정 살모넬라 분리를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. LAMP 분석은 특히 살모넬라 침략유전자(invA)를대상으로 하며 신속하고 민감하며 매우 특이적입니다. 템플릿 DNA는 동물 사료의 농축 국물 또는 추정 살모넬라 분리의 순수한 문화에서 제조됩니다. LAMP 시약 혼합물은 이더스 말 마스터 믹스, 프라이머, DNA 템플릿 및 물을 결합하여 제조됩니다. LAMP 분석은 30 분 동안 65 °C의 일정한 온도에서 실행됩니다. 긍정적인 결과는 실시간 형광을 통해 감시되고 5 분 일찍 검출될 수 있습니다. LAMP 분석법은 동물성 식품 또는 배양 배지의 억제제에 대한 높은 내성을 나타내며, 살모넬라를선별하고 확인하기 위한 신속하고 신뢰할 수 있고 견고하며 비용 효율적이며 사용자 친화적인 방법으로 사용된다. LAMP 방법은 최근 미국 식품의약국의 세균분석 매뉴얼(BAM) 제5장에 통합되었습니다.

그림 2 및 그림 3은 두 플랫폼에 표시된 대표 램프 그래프/테이블을 표시합니다. 이 LAMP 실행에서, 샘플 S1 에서 S6은 반응당 1.1 x 106 CFU에서 11 CFU에 이르기까지 S. enterica 세로바 인판티스 ATCC 51741의 10 배 직렬 희석이다. 양성 대조군은 반응당 1.7 x 104 CFU에서 S. 엔테리카 세로바 티피무륨 ATCC 19585(LT2)이며 NTC는 분자등급 수이다.
도 2E 및 도 3G에도시된 바와 같이 NTC 및 PC 웰은 모두 유효한 컨트롤입니다. NTC 우물은 빈 T맥스를 가지고 있으며,Tm은 LAMP 계기판에 83°C이고 LAMP 소프트웨어의 공백은 부정적인 결과를 시사합니다. PC우물은 두 플랫폼에서 7분 45초, Tm의 Tm을 모두 플랫폼에 90°C로 가지고 있어 긍정적인 결과를 시사한다. 샘플 S1 에서 S6까지의 T최대값은 6분 30초에서 12분 15초 사이이며, 모두 살모넬라양성입니다.
동일한 샘플 집합의 중복 된 실행에 따라 이러한 샘플에 대해 최종 LAMP 결과가 보고됩니다. 이 대표적인 LAMP 실행은 LAMP가 샘플에서 광범위한 농도로 살모넬라를 성공적으로 감지한다는 것을 보여줍니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2.jpg"> 그림 2: LAMP 계기판에 표시된 대표적인 램프 결과. (A) 프로파일 탭에는 프로그래밍된 온도 프로파일이 표시됩니다. (B) 온도 탭은 램프 반응이 진행됨에 따라 샘플 우물의 실제 온도를 나타낸다. (C) 증폭 탭은 램프 증폭 시 형광 측정값을 나타낸다. (D) 멸막 탭은 멸음 단계 동안 형광(유도체)의 변화를 나타낸다. (E) 결과 탭에는 LAMP 결과의 표 모양이 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2.jpg"> 그림 3: LAMP 소프트웨어에서 볼 수 있는 대표적인 램프 결과. (A) 프로파일 탭에는 프로그래밍된 온도 프로파일이 표시됩니다. (B) 온도 탭은 램프 반응이 진행됨에 따라 샘플 우물의 실제 온도를 나타낸다. (C) 증폭 탭은 램프 증폭 시 형광 측정값을 나타낸다. (D) 증폭 속도 탭은 램프 증폭 시 형광(형광비)의 변화를 나타낸다. (E) 담낭 탭은 막음 단계 동안 형광 측정값을 나타낸다. (F) 절전막 유도체 탭은 막음 단계 동안 형광(유도체)의 변화를 나타낸다. (G) 결과 탭에는 LAMP 결과의 표 모양뷰가 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

루프 매개 이소성 증폭(LAMP)은 병원체 검출 분야에 대한 폭넓은 관심을 받고 있는 이더스말 핵산 증폭 시험(iNAAT)이다. 여기서, 우리는 동물성 식품에서 살모넬라를 선별하고 문화 격리에서 추정 살모넬라를 확인하는 신속하고 신뢰할 수 있고 강력한 방법으로 다연구소 검증 살모넬라 LAMP 프로토콜을 제시합니다.

동물성 식품에서 살모넬라를 선별하고 문화 격리에서 살모넬라를 확인하기 위한 루프 중재 이더말 증폭

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has emerged as a powerful nucleic acid amplification test for the rapid detection of numerous bacterial, ...

loop-mediated-isothermal-amplification-for-screening-salmonella

Research

JoVE Journal

Biology

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

8.0K 조회수.  U.S. Food and Drug Administration. 루프 매개 이소성 증폭(LAMP)은 병원체 검출 분야에 대한 폭넓은 관심을 받고 있는 이더스말 핵산 증폭 시험(iNAAT)이다. 여기서, 우리는 동물성 식품에서 살모넬라를 선별하고 문화 격리에서 추정 살모넬라를 확인하는 신속하고 신뢰할 수 있고 강력한 방법으로 다연구소 검증 살모넬라 LAMP 프로토콜을 제시합니다.

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Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a particular foodborne illness outbreak has been challenging. This is because insects are not being aseptically collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations and because there is not a standardized method to detect foodborne bacteria from individual insects. To take a step towards solving this problem, we adapted a protocol from a commercially available PCR-based system that detects foodborne pathogens from food and environmental samples, to detect foodborne pathogens from individual flies.Using this standardized protocol, we surveyed 100 wild-caught flies for the presence of Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes and demonstrated that it was possible to detect and further isolate these pathogens from the body surface and the alimentary canal of a single fly. Twenty-two percent of the alimentary canals and 8% of the body surfaces from collected wild flies were positive for at least one of the three foodborne pathogens. The prevalence of Cronobacter spp. on either body part of the flies was statistically higher (19%) than the prevalence of S. enterica (7%) and L.monocytogenes (4%). No false positives were observed when detecting S. enterica and L. monocytogenes using this PCR-based system because pure bacterial cultures were obtained from all PCR-positive results. However, pure Cronobacter colonies were not obtained from about 50% of PCR-positive samples, suggesting that the PCR-based detection system for this pathogen cross-reacts with other Enterobacteriaceae present among the highly complex microbiota carried by wild flies. The standardized protocol presented here will allow laboratories to detect bacterial foodborne pathogens from aseptically collected insects, thereby giving public health officials another line of evidence to find out how the food was contaminated when performing foodborne outbreak investigations.

A PCR-based protocol was adapted to detect Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes from body surfaces and alimentary canals of individual wild-caught flies. The goal of this protocol is to detect and isolate bacterial pathogens from individual insects collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations.

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

연구

환경과학

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

면역학 및 감염병학

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus. However, there are two species, six subspecies, and over 2,500 different Salmonella serovars, and not all are equal in their significance to public health. For example, finding S. enterica subspecies IIIa Arizona on a table egg layer farm is insignificant compared to the isolation of S. enterica subspecies I serovar Enteritidis, the leading cause of salmonellosis linked to the consumption of table eggs. Serovars are identified based on antigenic differences in lipopolysaccharide (LPS)(O antigen) and flagellin (H1 and H2 antigens). These antigenic differences are the outward appearance of the diversity of genes and gene alleles associated with this phenotype.
We have developed an allelotyping, multiplex PCR that keys on genetic differences between four major S. enterica subspecies I serovars found in poultry and associated with significant human disease in the US. The PCR primer pairs were targeted to key genes or sequences unique to a specific Salmonella serovar and designed to produce an amplicon with size specific for that gene or allele. Salmonella serovar is assigned to an isolate based on the combination of PCR test results for specific LPS and flagellin gene alleles. The multiplex PCRs described in this article are specific for the detection of S. enterica subspecies I serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium.
Here we demonstrate how to use the multiplex PCRs to identify serovar for a Salmonella isolate.

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

We describe a multiplex PCR for the rapid detection of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium. Specific Salmonella serovars can be identified by targeting a multiplex PCR to genes and sequences unique to the O-antigen biosynthesis cluster and flagellin of a given serovar. Serovar is assigned then to a Salmonella isolate based on the appearance of specific, size amplicons (PCR product) corresponding to the target allele.

확인을 위해 Allelotyping PCR 살모넬라 enterica serovars Enteritidis, 해더, 하이 델베르크, 그리고 Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

Application of the Intelligent High-Throughput Antimicrobial Sensitivity Testing/Phage Screening System and Lar Index of Antimicrobial Resistance

To improve the efficiency of antimicrobial susceptibility testing (AST) and phage high-throughput screening for resistant bacteria and to reduce the detection cost, an intelligent high-throughput AST/phage screening system, including a 96-dot matrix inoculator, image acquisition converter, and corresponding software, was developed according to AST criteria and the breakpoints of resistance (R) formulated by the Clinical &amp; Laboratory Standards Institute (CLSI). AST and statistics of minimum inhibitory concentration (MIC) distributions (from R/8 to 8R) of 1,500 Salmonella strains isolated from poultry in Shandong, China, against 10 antimicrobial agents were carried out by the intelligent high-throughput AST/phage screening system. The Lar index, meaning "less antibiosis, less resistance and residual until little antibiosis", was obtained by calculating the weighted average of each MIC and dividing by R. This approach improves accuracy in comparison with using the prevalence of resistance to characterize the antimicrobial resistance (AMR) degree of highly resistant strains. For the strains of Salmonella with high AMR, lytic phages were efficiently screened from the phage library by this system, and the lysis spectrum was computed and analyzed. The results showed that the intelligent high-throughput AST/phage screening system was operable, accurate, highly efficient, inexpensive, and easy to maintain. Combined with the Shandong veterinary antimicrobial resistance monitoring system, the system was suitable for scientific research and clinical detection related to AMR.

Here we introduce the principle, structure, and instruction of the intelligent high-throughput antimicrobial sensitivity testing/phage screening system. Its application is illustrated by using Salmonella isolated from poultry in Shandong, China, as an example. The Lar index is calculated, and its significance in evaluating antimicrobial resistance is discussed comprehensively.

지능형 고처리량 항균 감수성 검사/파지 스크리닝 시스템 적용 및 항생제 내성 LAR 지수

To improve the efficiency of antimicrobial susceptibility testing (AST) and phage high-throughput screening for resistant bacteria and to reduce the ...

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

The bacterial infected mouse model is a powerful model system for studying areas such as infection, inflammation, immunology, signal transduction, and tumorigenesis. Many researchers have taken advantage of the colitis induced by Salmonella typhimurium for the studies on the early phase of inflammation and infection. However, only few reports are on the chronic infection in vivo. Mice with Salmonella persistent existence in the gastrointestinal tract allow us to explore the long-term host-bacterial interaction, signal transduction, and tumorigenesis. We have established a chronic bacterial infected mouse model with Salmonella typhimurium colonization in the mouse intestine over 6 months. To use this system, it is necessary for the researcher to learn how to prepare the bacterial culture and gavage the animals. We detail a methodology for prepare bacterial culture and gavage mice. We also show how to detect the Salmonella persistence in the gastrointestinal tract. Overall, this protocol will aid researchers using the bacterial infected mouse model to address fundamentally important biological and microbiological questions.

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

Establish a chronic bacterial infected mouse model with persistent Salmonella typhimurium colonization in intestine for 27 weeks.

만성의 살모넬라균 감염된 마우스 모델

The bacterial infected mouse model is a powerful model system for studying areas such as infection, inflammation, immunology, signal transduction, and ...

생물학

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

Tilapia lake virus disease (TiLVD), an emerging viral disease in tilapia caused by the tilapia lake virus (TiLV), is a persistent challenge in the aquaculture industry that has resulted in the mass morbidity and mortality of tilapia in many parts of the world. An effective, rapid, and accurate diagnostic assay for TiLV infection is therefore necessary to detect the initial infection and to prevent the spread of the disease in aquaculture farming. In this study, a highly sensitive and practical reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) method is presented to detect tilapia lake virus in fish tissue. A comparison of the RT-qPCR and RT-LAMP assays of infected samples revealed positive results in 63 (100%) and 51 (80.95%) samples, respectively. Moreover, an analysis of uninfected samples showed that all 63 uninfected tissues yielded negative results for both the RT-qPCR and RT-LAMP assays. The cross-reactivity with five pathogens in tilapia was evaluated using RT-LAMP, and all the tests showed negative results. Both the liver and mucus samples obtained from infected fish showed comparable results using the RT-LAMP method, suggesting that mucus can be used in RT-LAMP as a nonlethal assay to avoid killing fish. In conclusion, the results demonstrated that the presented RT-LAMP assay provides an effective method for TiLV detection in tilapia tissue within 1 h. The method is therefore recommended as a screening tool on farms for the rapid diagnosis of TiLV.

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

We present an RT-LAMP assay for the detection of TiLV in tilapia fish using simple instruments over a relatively short period of time compared to conventional RT-PCR techniques. This protocol may help control the epidemic spread of TiLVD, especially in developing countries.

틸라피아 호수 바이러스의 특이적이고 신속한 검출을 위한 역전사 루프 매개 등온 증폭(RT-LAMP) 분석

Tilapia lake virus disease (TiLVD), an emerging viral disease in tilapia caused by the tilapia lake virus (TiLV), is a persistent challenge in the ...

등온 증폭을 이용한 인간 호흡기 세균 감염 진단

Rapid Detection of Bacterial Pathogens Causing Lower Respiratory Tract Infections via Microfluidic-Chip-Based Loop-Mediated Isothermal Amplification

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will provide practical guidelines for managing and treating RTIs. This study describes a method for rapidly detecting bacterial pathogens that cause respiratory tract infections via multi-channel loop-mediated isothermal amplification (LAMP). LAMP is a sensitive and specific diagnostic tool that rapidly detects bacterial nucleic acids with high accuracy and reliability. The proposed method offers a significant advantage over traditional bacterial culturing methods, which are time-consuming and often require greater sensitivity for detecting low levels of bacterial nucleic acids. This article presents representative results of K. pneumoniae infection and its multiple co-infections using LAMP to detect samples (sputum, bronchial lavage fluid, and alveolar lavage fluid) from the lower respiratory tract. In summary, the multi-channel LAMP method provides a rapid and efficient means of identifying single and multiple bacterial pathogens in clinical samples, which can help prevent the spread of bacterial pathogens and aid in the appropriate treatment of RTIs.

저자 스포트라이트: Advancing Rapid detection of respiratory Pathogens Using Microfluidic Chip(미세유체 칩을 사용한 호흡기 병원체의 신속한 검출 발전) 

Various bacterial pathogens can cause respiratory tract infections and lead to serious health issues if not detected accurately and treated promptly. Rapid and accurate detection of these pathogens via&#160;loop-mediated isothermal amplification provides effective management and control of respiratory tract infections in clinical settings.

Microfluidic-Chip-based Loop-Mediated Isothermal Amplification을 통해 하기도 감염을 일으키는 세균성 병원체의 신속한 검출

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will ...

동물성 식품에서 살모넬라를 선별하고 문화 격리에서 살모넬라를 확인하기 위한 루프 중재 이더말 증폭

요약

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Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서 하이브 리다이 제이션 살모넬라균* 신선한 농산물에 대한*

확인을 위해 Allelotyping PCR 살모넬라 enterica serovars Enteritidis, 해더, 하이 델베르크, 그리고 Typhimurium

지능형 고처리량 항균 감수성 검사/파지 스크리닝 시스템 적용 및 항생제 내성 LAR 지수

만성의 살모넬라균 감염된 마우스 모델

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

틸라피아 호수 바이러스의 특이적이고 신속한 검출을 위한 역전사 루프 매개 등온 증폭(RT-LAMP) 분석

Microfluidic-Chip-based Loop-Mediated Isothermal Amplification을 통해 하기도 감염을 일으키는 세균성 병원체의 신속한 검출

Microfluidic-Chip-based Loop-Mediated Isothermal Amplification을 통해 하기도 감염을 일으키는 세균성 병원체의 신속한 검출

Microfluidic-Chip-based Loop-Mediated Isothermal Amplification을 통해 하기도 감염을 일으키는 세균성 병원체의 신속한 검출

동물성 식품에서 살모넬라를 선별하고 문화 격리에서 살모넬라를 확인하기 위한 루프 중재 이더말 증폭

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접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

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지능형 고처리량 항균 감수성 검사/파지 스크리닝 시스템 적용 및 항생제 내성 LAR 지수

만성의 살모넬라균 감염된 마우스 모델

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

틸라피아 호수 바이러스의 특이적이고 신속한 검출을 위한 역전사 루프 매개 등온 증폭(RT-LAMP) 분석

Microfluidic-Chip-based Loop-Mediated Isothermal Amplification을 통해 하기도 감염을 일으키는 세균성 병원체의 신속한 검출

Microfluidic-Chip-based Loop-Mediated Isothermal Amplification을 통해 하기도 감염을 일으키는 세균성 병원체의 신속한 검출

Microfluidic-Chip-based Loop-Mediated Isothermal Amplification을 통해 하기도 감염을 일으키는 세균성 병원체의 신속한 검출

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서 하이브 리다이 제이션 살모넬라균* 신선한 농산물에 대한*